Automation for LC/MS Sample Preparation: High Throughput In-Solution Digestion and Peptide Cleanup Enabled by the Agilent AssayMAP Bravo Platform

Význam tématu

Automatizace přípravy vzorků pro LC/MS proteomiku odstraňuje úzká místa spojená s manuálními operacemi, zvyšuje výkon, opakovatelnost a usnadňuje přenos protokolů mezi laboratořemi. Díky tomu je možné zrychlit analýzy a zpracovat stovky až tisíce vzorků výzkumného či klinického charakteru.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo zavést a otestovat automatizované protokoly in-solution digesce a následného čištění peptidů na platformě Agilent AssayMAP Bravo. Pomocí modelové proteiny BSA byly hodnoceny parametry reprodukovatelnosti, výtěžnosti a kapacity systému při paralelním zpracování desítek vzorků.

Použitá instrumentace

• Agilent AssayMAP Bravo liquid handler
• Disposable microchromatography cartridges—C18 a RP-S (96-well)
• Agilent PlateLoc Thermal Microplate Sealer
• Agilent 1290 Infinity LC System
• Agilent 6550 iFunnel QTOF LC/MS s Dual Jet Stream ESI

Použitá metodika

In-solution digesce:

• Paralelní zpracování 4×32 vzorků BSA (225 µg/well) v 96-well desce, celkem 128 replikátů
• Dva typy denaturace: 8 M guanidin HCl vs 9 M urea, následná alkylace IAM a digesce trypsinem
• Inkubace: 60 °C denaturace 1 h, 37 °C digesce přes noc

Peptidové čištění:

• Nasazení 96 C18 nebo RP-S cartridgí na desku
• Equilibrace, naložení vzorku (3–75 µg peptidu), proplach a eluce v 70 % ACN/0,1 % FA
• Lyofilizace a rekonstituce, vstřik 0,5–1 µg na LC/MS

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukovatelnost digesce:

• %CV pro 25 charakteristických peptidů BSA při denaturaci guanidinem: 2,3–2,6 % (intra-/inter-denní)
• S urealovým denaturantem %CV 3,3–3,7 %

Výtěžnost čištění:

• Peptidy s nízkou až střední hydrofobicitou: 87–100 % recovery při 3–75 µg naložené hmoty, %CV ≤2,1 %
• Kapacita cartridgí: nezměněná selektivita do ~100 µg, po překročení dochází k částečné ztrátě hydrofilních peptidů

Přínosy a praktické využití metody

Platforma umožňuje:

• Škálovatelné paralelní zpracování desítek až stovek vzorků
• Minimalizaci variability a odstředění operátorských efektů
• Rychlé nastavování a přenositelnost protokolů mezi laboratořemi
• Použití v klinickém výzkumu, biomarkerových studiích a QA/QC aplikacích

Budoucí trendy a možnosti využití

• Adaptace na různé enzymy, složitější biologické matrixy a multiplexní digesci
• Využití strojového učení pro optimalizaci protokolů a předpověď výtěžností
• Integrace s on-line systémy pro úplně bezobslužné workflow

Závěr

Agilent AssayMAP Bravo výrazně zvyšuje reprodukovatelnost, flexibilitu a throughput přípravy vzorků pro LC/MS proteomiku. Díky ověřené spolehlivosti digesce i čištění peptidů je vhodný pro rozsáhlé studie vyžadující konzistentní výsledky a vysokou kapacitu zpracování.

Reference

Spicer V., et al. Sequence-specific retention calculator. A family of peptide retention time prediction algorithms in reversed-phase HPLC: Applicability to various chromatographic conditions and columns. Anal. Chem. 79(22), 8762–8768 (2007).