Antibody Quantification Using ProteinWorks eXpress Digest Kits and Multiple Plasma Volumes

Význam tématu

V posledních letech se kvantitativní LC-MS/MS stalo klíčovou metodou pro analýzu proteinů a peptidů v biologických matricích díky vysoké specifičnosti, rozšířenému dynamickému rozsahu a možnosti multiplexního stanovení.
Potřeba minimalizovat objem vzorku (<50 µl) a zkrátit čas metody vede k vývoji standardizovaných, snadno implementovatelných postupů vhodných pro laboratorní prostředí i preklinické studie.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo ověřit univerzálnost a flexibilitu kitového řešení ProteinWorks eXpress Direct Digest pro kvantifikaci čtyř monoklonálních protilátek (infliximab, adalimumab, bevacizumab a trastuzumab) v plazmě.
Testovaly se tři počáteční objemy plazmy (15, 35 a 70 µl) při koncentracích 5–50 µg/ml, přičemž každá analýza probíhala podle jednotného protokolu digesce.

Použitá metodika a instrumentace

Pro zpracování vzorků byl použit kit ProteinWorks eXpress Direct Digest Kit, zahrnující:

• enzymatickou digesci trypsinem přímo v plazmě
• neutralizaci a přípravu vzorku k LC-MS/MS
• monitorování vybraných signature peptidů pomocí multiple reaction monitoring (MRM)

Hlavní instrumentace:

• kapalinová chromatografie spojená s hmotnostním spektrometrem ve dvojitém kvadrupólu (LC-MS/MS)

Hlavní výsledky a diskuse

Ve všech třech objemech vzorku byly standardní kalibrační křivky lineární s korelačním koeficientem r2 ≥ 0,99 a vážením 1/x.
Průměrná odchylka stanovení jednotlivých bodů kalibrace dosahovala hodnot 99–100 % přesnosti.
Chromatografické špičky vybraných signature peptidů vykazovaly vynikající tvar a oddělení, což potvrdilo robustnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Kitové řešení eliminuje potřebu optimalizovat individuální digesční podmínky pro každou protilátku a objem vzorku.
Jednotný protokol výrazně zjednodušuje nasazení v routine laboratořích a zkracuje dobu přípravy vzorků.
Možnost použití malých objemů plazmy je výhodná pro preklinické studie i klinické odběry s omezeným dostupným množstvím materiálu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se zaměří na plnou automatizaci přípravy vzorků a rozšíření kitů o interní standardy pro ještě vyšší přesnost.
Integrace cílené proteomiky s kvantitativními metodami může dále zefektivnit multiplexní stanovení proteinů a peptidů v biologických vzorcích.

Závěr

Studie prokázala, že ProteinWorks eXpress Direct Digest Kit nabízí flexibilní, jednoduchý a robustní postup pro kvantifikaci monoklonálních protilátek v plazmě od 15 do 70 µl.
Metoda poskytuje vysokou přesnost, linearitu a reprodukovatelnost bez nutnosti rozsáhlého vývoje nové procedury.

Reference

• Orens P., Lame M., Naughton S., Chambers E. Antibody Quantification Using ProteinWorks eXpress Digest Kits and Multiple Plasma Volumes. Waters Corporation, 2016.