A Generic Kit-Based Approach for LC-MS/MS Quantification of Urinary Albumin for Clinical Research

Význam tématu

Albumin je klíčovým biomarkerem ledvinné funkce. Za normálních podmínek se v moči vyskytuje ve velmi nízkých koncentracích, zatímco při poškození ledvin jeho hladina rychle roste. Tradiční imunoturbidimetrické či ELISA metody sice nabízejí citlivost, ale trpí omezenou reprodukovatelností, křížovou reaktivitou a omezeným dynamickým rozsahem. LC-MS/MS se vyznačuje vysokou selektivitou, možností multiplexu a širokým dynamickým rozsahem, avšak doposud byl časově náročný a komplexní.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout univerzální, kitově založenou LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci albuminu v moči s vysokou citlivostí (0,1–500 µg/mL), zkráceným vzorkovacím postupem (<4 h) a vynikající reprodukovatelností napříč různými vzorky moči.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: 15 µL lidské moči, standardy a QC spiked albumin 0,1–500 µg/mL
• Enzymatická digesce: ProteinWorks eXpress Digest Kit (5-krokový protokol s redukcí a alkylací, 2 h)
• Čištění peptidů: ProteinWorks µElution SPE Clean-Up Kit (Oasis MCX mixed-mode sorbent, 50 µL eluátu)
• Chromatografie: ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 1,7 µm, 2,1×150 mm, 0,3 mL/min, gradient 0,1 % FA v H2O/ACN
• MS/MS: Xevo TQ-XS, ESI+ MRM, monitorováno 11 HSA tryptických peptidů, 4 primární pro kvantifikaci (YLYEIAR, FQNALLVR, LVNEVTEFAK, VFDEFKPLVEEPQNLIK)

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekční limit: 0,1 µg/mL; lineární rozsah: 0,1–500 µg/mL, R² > 0,99
• Celkový čas přípravy vzorku: <4 h (vs. ~24 h u dřívějších LC-MS metod)
• Přesnost a opakovatelnost: QC CV < 5 %, přesnost 85–115 %
• Bez SPE čistění se nepodařilo splnit QC kritéria; se SPE průměrné CV ~ 2 % a % accuracy 85–115 %
• Endogenní koncentrace albuminu v 3 nezávislých šaržích moči: 2,13 ± 0,06 µg/mL; 11,02 ± 0,37 µg/mL; 6,24 ± 0,24 µg/mL (CV < 4 %)
• Potvrzeno také 10 doplňkových peptidů; jeden peptide (LVAASQAALGL) vykazoval odchylku pravděpodobně následkem miscleavage

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní kvantifikace nízkých i vysokých hladin albuminu v moči
• Zkrácení přípravy vzorku a snadný přechod na rutinní workflow díky komerčním kitům
• Možnost rozšíření na multiplexní stanovení dalších proteinových biomarkerů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace vzorkové přípravy pro vysokoprůchodové analýzy
• Adaptace na další proteinové markery v klinickém výzkumu
• Personalizovaná medicína a dlouhodobý monitoring onemocnění
• Vývoj citlivějších sorbentů a technik pro další snížení detekčních limitů

Závěr

Popisovaná LC-MS/MS metoda využívající sady ProteinWorks pro digesci a SPE nabízí rychlou (<4 h), citlivou (0,1 µg/mL) a reprodukovatelnou kvantifikaci albuminu v moči. Dosahované výsledky se blíží citlivosti imunotestů a současně poskytují širší dynamický rozsah a vysokou selektivitu.

Reference

1. Fanali G. et al. Human serum albumin: from bench to bedside. Mol Aspects Med. 2012;33:209–290.
2. Tesch GH. Serum and urine biomarkers of kidney disease: a pathophysiological perspective. Nephrology. 2010;15:609–616.
3. Beasley-Green A. et al. Multiplexed LC-MS/MS assay for urine albumin. J Proteome Res. 2014;13:3930–3939.
4. de Jong PE. et al. Macro-albuminuria and micro-albuminuria: Do both predict events with similar strength? Nephrol. 2007;20:375–380.
5. Polkinghorne KR. Detection and measurement of urinary protein. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2006;15:625–630.
6. Choi S. et al. On-site quantification of human urine albumin by fluorescence immunoassay. Clin Chem. 2004;50:1052–1055.
7. Seegmiller JC. et al. Comparison of urine albumin quantification by immunoturbidimetry and LC-MS/MS. Clin Chem. 2009;55:1991–1994.