Sensitive and Reproducible LC-MS Quantification of C-Reactive Protein in Plasma: A Potential Biomarker of Inflammation

Význam tématu

C-reaktivní protein (CRP) je akutně fáze protein syntetizovaný v játrech jako odpověď na zánět. Hladiny CRP v plazmě stoupají více než stořádově, což jej činí klíčovým markerem chronických onemocnění (revmatoidní artritida), kardiovaskulárního rizika a zánětlivých nádorových procesů. Tradiční ligandové imunotesty mají omezený dynamický rozsah, obtížnou standardizaci a vyžadují opakovaná měření k pokrytí širokého spektra koncentrací.

Cíle a přehled studie / článku

Tento application note prezentuje standardizovaný kitem řízený workflow pro kvantifikaci endogenního CRP v lidské plazmě pomocí LC-MS. Cílem je dosáhnout vysoké citlivosti, reprodukovatelnosti a rychlého zpracování vzorků s dolní mezí kvantifikace (LLOQ) 0,025–0,1 µg/mL z pouhých 35 µL plazmy v čase digestce 2 hodiny.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byla využita bottom-up proteomické strategie:

• ProteinWorks eXpress Direct Digest Kit – 3kroková enzymatická digesce bez redukce/alalkylace, 2 h
• ProteinWorks µElution SPE Clean-Up Kit (Oasis MCX) – smíšená reverzní fáze a iontová výměna pro specifickou očistu peptidů
• ACQUITY UPLC HSS T3 Column, 1,8 µm, 2,1×50 mm pro zlepšenou retenci polárních tryptických peptidů
• ACQUITY UPLC System s gradientem 0,1% formiové kyseliny ve vodě a acetonitrilu, 5 µL injekce, kolona na 55 °C
• Xevo TQ-XS Mass Spectrometer v režimu ESI+ MRM, optimalizované přechody pro peptidy AFVPFK, ESDTSYVSLK a GYSIFSYATK
• Data management a kvantifikace v softwaru MassLynx a TargetLynx

Hlavní výsledky a diskuse

• Dynamický rozsah metody přes čtyři řády (0,025–100 µg/mL), lineární regrese R2>0,99.
• LLOQ 0,025 µg/mL v potkaní a 0,05 µg/mL v lidské plazmě; přesnost 89–106 %; preciznost (RSD) <5 %.
• Upgrade z Xevo TQ-S na Xevo TQ-XS přinesl zlepšení S/N signálu 2,5–3,5× a snížení matrice interferencí až 7×.
• ACQUITY UPLC HSS T3 zajistila úzké chromatografické píky (<4,5 s) a spolehlivou separaci.
• Endogenní CRP v 4 lo-tech lidské plazmy se pohybovalo mezi 0,4–18,1 µg/mL, primární a konfirmatorní MRM přechody souhlasily do 10 %.
• Peptid GYSIFSYATK vykazoval odchylky pravděpodobně kvůli koeluci matrice.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow umožňuje rychlou přípravu vzorků (<3 h), vysokou citlivost a selektivitu bez nutnosti afinitní extrakce. Metoda vhodná pro klinické laboratoře, výzkum a QA/QC v průmyslové analytice. Multiplexní MRM detekce umožňuje rozšíření o další biomarkery.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší adopce standardizovaných kitů pro proteomickou kvantifikaci, automatizace zpracování, validace pro klinické použití a rozvoj multiplexních panelů. Další zdokonalení citlivosti hmotových spektrometrů a standardizace podpoří přechod od imunotestů k LC-MS.

Závěr

Kitem řízený přístup spolu s Xevo TQ-XS poskytuje vysoce citlivou, selektivní a rychlou metodu kvantifikace CRP v plazmě. Metoda splňuje požadavky klinické přesnosti, širokého dynamického rozsahu a jednoduché reprodukovatelnosti, čímž přispívá k nahrazení konvenčních imunotestů LC-MS technologií.

Reference

• C-reactive protein, pentameric structure In: Wikipedia 2016
• Kun E, Wu J, Karl J, Liao H, Zolg W, Guild B Quantification of c-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards Proteomics 2004 4 1175–1186
• Mayo Clinic C-reactive protein test Mayo Clin Proc 2014
• Allin KH, Nordestgaard BG Elevated c-reactive protein in the diagnosis, prognosis, and cause of cancer Crit Rev Clin Lab Sci 2011 48(4) 155–170
• Rezelia M, Végvária A, Silajdžić E et al Inflammatory markers in Huntington’s disease plasma-A robust nanoLC-MRM-MS assay development EuPA Open Proteomics 2014 3 68–75
• Skyline targeted mass spec environment MacCoss Labs University of Washington 2016
• UniProt Consortium UniProtKB P02741 CRP_Human UniProt 2014