Spotřební materiál, HPLC, LC kolony
ZaměřeníProteomika
VýrobceWaters
Význam tématu
Nečistoty syntetických peptidů vznikají během výroby a skladování a je nezbytné je spolehlivě charakterizovat a monitorovat, protože mohou ovlivnit bezpečnost a účinnost terapeutických peptidů.
Reverzní fázová chromatografie se díky svému vysokému rozlišení stala klíčovou metodou pro separaci peptidových nečistot.
Cíle a přehled studie
Studie se zaměřuje na vývoj a optimalizaci metody pro analýzu nečistot syntetického peptidu eledoisin.
Klíčové cíle:
- Optimalizace gradientu a průtoku pro maximální rozlišení.
- Vyhodnocení vlivu délky kolony a teploty separace.
- Přenos metody z UPLC (sub-2 µm částice) na HPLC (>2 µm částice) s udržením rozlišení.
Použitá metodika a instrumentace
Ultrarychlá kapalinová chromatografie (UPLC) na systému ACQUITY UPLC H-Class Bio System s kolonkami:
- Peptide CSH C18, 130 Å, 1,7 µm (2,1×150; 2,1×100; 2,1×75; 2,1×50 mm).
- XSelect Peptide CSH C18 XP, 130 Å, 2,5 µm (4,6×150 a 4,6×75 mm).
- A: 0,1 % TFA ve vodě.
- B: 0,1 % TFA v acetonitrilu.
Podmínky: teplota vzorku 4 °C, teplota kolony 60 °C, průtok 0,2–0,3 mL/min, objemy injekcí 1–10 µL.
Hlavní výsledky a diskuse
Gradient a průtok:
- Shallow gradient (0,69 % DB/CV) a nižší průtok výrazně zvyšují poměr vrchol‐údolí (p/v) a rozlišení.
- Se zvětšením délky kolony (50→150 mm) roste rozlišení v poměru k odmocnině z délky, avšak rostou doby analýzy.
- Vyšší teplota (60 °C vs. 40 °C) zmenšuje šířku vrcholů díky rychlejší izomerizaci peptidu obsahujícího prolin.
- Při zachování poměru L/dp a upraveném gradientu lze přenést metodu z UPLC na HPLC pomocí spojených kolonek (>2 µm), čímž se udrží rozlišení, ale prodlouží doba běhu.
- Alternativně je možné použít samostatnou 2,5 µm kolonu pro snížení délky analýzy při akceptovatelném kompromisu v rozlišení.
Přínosy a praktické využití metody
Metoda poskytuje robustní protokol pro profilování nečistot syntetických peptidů a usnadňuje kvalifikaci a kontrolu kvality v laboratořích s různou instrumentací.
Budoucí trendy a možnosti využití
- Integrace s hmotnostní spektrometrií pro strukturní identifikaci nečistot.
- Využití nových stacionárních fází a automatizovaných nástrojů pro vývoj metod.
- Rozšíření na další třídy terapeutických peptidů.
Závěr
Optimalizace gradientu, délky kolony a teploty jsou klíčové pro účinné rozlišení nečistot peptidu eledoisin.
Sub-2 µm částice na UPLC nabízejí vysokou účinnost bez navýšení doby analýzy.
Přenos na HPLC s vhodným škálováním umožňuje flexibilní využití v různých pracovních prostředích.
Reference
- Sanz-Nebot V., Toro I., Barbosa J. Fractionation and characterization of a crude peptide mixture from the synthesis of eledoisin by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1999, 846, 25–38.
- USP Chapter <621>. Chromatography.
- Gilar M., Neue U.D. Peak capacity in gradient reversed-phase liquid chromatography of biopolymers: theoretical and practical implications for the separation of oligonucleotides. J. Chromatogr. A. 2007, 1169(1–2), 139–150.
- Xie H., Gilar M. Improving LC peak shape of proline-rich peptides within an antibody peptide map. Waters Application Note 720003063EN, May 2009.
- Yang H., Koza S., Warren B., Chen W. Synthetic peptide impurity analysis on Waters reversed-phase columns. Waters Application Note 720006244EN, April 2018.
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
