Automated and Standardized, Kit-Based Workflow for Protein Quantification

Význam tématu

Proteiny v biologických vzorcích představují klíčové parametry ve výzkumu, klinických aplikacích i kvalitativní kontrole. Přesná a reprodukovatelná kvantifikace proteinů umožňuje lepší diagnostiku, monitorování léčby a vývoj farmaceutických produktů. Standardizace a automatizace vzorkových postupů minimalizuje variabilitu a zefektivňuje analytickou práci v laboratoři.

Cíle a přehled studie

V této studii se autoři zaměřili na validaci kompletně automatizovaného, kit‐based workflow pro kvantifikaci proteinů metodou bottom‐up.

• Cíl: Demonstrovat přesnost a reprodukovatelnost kvantifikace C‐reaktivního proteinu (CRP) a monoklonální protilátky infliximab v plasmatických vzorcích.
• Přehled: Vzorky byly zpracovány enzymatickou digestí a následnou SPE purifikací pomocí komerčních kitů ProteinWorks Auto‐eXpress a robotu Hamilton Microlab STAR.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorková preparace: ProteinWorks Auto‐eXpress Digest Kit pro digesti proteinů a µElution SPE Clean‐Up Kit pro purifikaci peptidů.
• Automatizace: liquid handler Hamilton Microlab STAR pro pipetování pre‐měřených reagencií a kroků čištění.
• Chromatografie: Waters ACQUITY UPLC HSS T3 kolona (2.1 × 50 mm, 1.8 µm) při 55 °C, gradientní eluce (0.3 mL/min, fáze A: voda + 0.1 % kyseliny mravenčí, B: acetonitril + 0.1 % kyseliny mravenčí).
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo TQ-S Triple Quadrupole MS v MRM režimu, optimalizované MRM přechody pro charakteristické peptidy CRP a infliximabu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Porovnání manuální a automatizované digestie ukázalo odchylku průměrných areálních signálů <25 % a intra-denní CV ≤15 % pro vybrané tryptické peptidy.
• Lineární rozsah kalibračních křivek: 1–100 µg/mL pro CRP, 0,75–250 µg/mL pro infliximab, korelace r2 ≥0,992.
• Přesnost kalibrace: 98–101 % pro CRP, 98–100 % pro infliximab, reproducibilita QC vzorků s CV do 13 %.
• Automatizované zpracování kombinované s kit-based přístupem zkrátilo dobu přípravy a minimalizovalo riziko chyb operátora.

Přínosy a praktické využití metody

• Standardizace workflow redukuje čas i nároky na zkušenosti obsluhy.
• Modulární kit-based přístup umožňuje široké uplatnění pro různé proteiny a biologické matice.
• Vysoká přesnost a reprodukovatelnost je vhodná pro bioanalýzy v klinickém výzkumu i farmaceutickém vývoji.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření automatizace o další kroky, např. stabilizační úpravy vzorků a multiplexní analýzy.
• Integrace do pokročilých bioinformatických platforem pro rychlou analýzu dat a reporting.
• Vývoj kitů pro nekonvenční matice (tkáně, buňky) a stopy biomarkerů s citlivější detekcí.

Závěr

Automatizované kit-based řešení s ProteinWorks Auto-eXpress a Hamilton Microlab STAR pro bottom-up kvantifikaci proteinů prokázalo vysokou přesnost, reprodukovatelnost i efektivitu. Standardizovaný postup usnadňuje implementaci v různých bioanalytických laboratořích a podporuje rychlý vývoj a validaci metod.

Reference

• Waters Corporation. Technology Brief: Automated and Standardized, Kit-Based Workflow for Protein Quantification. 2018.