PROTEOMICKÁ ANALÝZA VZORKŮ KONDENZÁTU VYDECHOVANÉHO VZDUCHU PROKÁZALA VYSOKOU REPRODUKOVATELNOST HMOTNOSTNĚ SPEKTROMETRICKÝCH MĚŘENÍ

Význam tématu

Odhalování biomarkerů v kondenzátu vydechovaného vzduchu představuje neinvazivní způsob sledování patologických procesů v plicích. EBC obsahuje vzácně koncentrované proteiny, které mohou indikovat časný zánět, imunitní reakce či nádorové onemocnění. Mass spectrometrie s vysokým rozlišením umožňuje citlivou detekci těchto biomolekul navzdory nízké koncentraci a složité matrici EBC.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo

• vyvinout a ověřit metodu koncentrace a analýzy proteomického profilu EBC,
• zhodnotit reprodukovatelnost mezi technickými a biologickými replikáty,
• porovnat proteomické profily individuálních vzorků od zdravých jedinců.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly odebrány přístrojem TurboDECCS (Medivac, Itálie) od dvou dětí (8, 11 let) a jejich otce (45 let) ve třech časových bodech. Proteiny byly lyofilizovány ve SpeedVac (Thermo Fisher Scientific), rozpuštěny v TEZ pufru a podrobeny redukci DTT, alkylaci, tryptické digesci (Promega) a purifikaci peptidů na C18 Stage tipech. Peptidy byly separovány na nanoUHPLC Dionex UltiMate 3000 RSLC a analyzovány na Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific) s nanoESI, gradientem 2–35 % acetonitrilu (95 min), master scanem v Orbitrapu (120 000), CID fragmentací a detekcí v iontové pasti.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve 27 technických replikátech z 9 biologických vzorků bylo identifikováno 2797 unikátních proteinů a kvantifikováno 2263 proteinů na základě 4189 peptidů. Průměrně se v jednom technickém měření detekovalo 1056 ± 354 proteinů, při konsolidaci dat stouplo číslo na 1198 ± 454 proteinů. Ve vzorcích otce bylo identifikováno 1603 ± 607 proteinů, v případě dcer 996 ± 140 proteinů, přičemž hlavními nalezenými molekulami byly keratiny a proteiny imunitního původu. Funkční analýza prokázala významné zastoupení procesů spojených s korifikací, diferenciací epitelu a imunitní odpovědí.

Přínosy a praktické využití

Metoda nabízí

• citlivou a reprodukovatelnou platformu pro profilování EBC proteomu u jednotlivců,
• detekci stovek proteinů z malého objemu vzorku (1–3 mL),
• možnost identifikace potenciálních biomarkerů plicních onemocnění,
• vhodnost pro longitudinální i populační studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace vysokorozlišovací MS s kvantitativními přístupy (SILAC, TMT), single particle EBC analýzou a multi-omics. Vývoj miniaturizovaných odběrových zařízení, automatizovaných příprav vzorků a pokročilé bioinformatiky umožní rutinní diagnostiku astmatu, CHOPN a časnou detekci plicního karcinomu.

Závěr

Vyvinutá metodika hmotnostně spektrometrické analýzy EBC prokázala vysokou citlivost a reprodukovatelnost s odchylkami technických replikátů <10 % od průměru. Metoda umožňuje spolehlivou detekci stovek proteinů i z nízkokoncentrovaného vzorku a otevírá cestu k neinvazivnímu sledování plicních onemocnění.

Reference

• Horváth I. et al.: Eur. Respir. J. 26, 523 (2005)
• Rosias P. P. et al.: Pediatr. Allergy Immunol. 21, e235 (2010)
• Konstantinidi E. M. et al.: Sci. World J. 2015, 435160
• Mutlu G. M. et al.: Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164, 731 (2001)
• Griese M., von Bredow C.: Proteomics 2, 690 (2002)
• Shahid S. K. et al.: Am. J. Respir. Crit. Care Med. 165, 1290 (2002)
• Leung T. F. et al.: Int. Arch. Allergy Immunol. 137, 66 (2005)
• Gianazza E. et al.: Am. J. Med. 117, 51 (2004)
• Gessner C. et al.: Respir. Med. 102, 299 (2008)
• Fumagalli M. et al.: J. Proteomics 71, 211 (2008)
• Bloemen K. et al.: Proteomics Clin. Appl. 3, 498 (2009)
• Kurova V. S. et al.: Clin. Chem. Lab. Med. 47, 706 (2009)
• Núñez-Naveira L. et al.: Lung 197, 523 (2019)
• Muccilli V. et al.: J. Pharm. Biomed. Anal. 105, 134 (2015)
• Lacombe M. et al.: J. Breath Res. 12, 021001 (2018)
• Kononikhin A. S. et al.: J. Chromatogr. B 1047, 97 (2017)
• Fedorchenko K. U. et al.: Mosc. Univ. Chem. Bull. 71, 134 (2016)
• López-Sánchez L. M. et al.: Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 313, L664 (2017)
• Sun C. et al.: J. Proteomics 206, 103392 (2019)
• Rappsilber J., Ishihama Y., Mann M.: Anal. Chem. 75, 663 (2003)
• R-project.org (staženo 20. 12. 2018)
• Bredberg A. et al.: Clin. Chem. 58, 431 (2012)
• Fumagalli M. et al.: Int. J. Mol. Sci. 13, 13894 (2012)