CHEMILUMINISCENČNÍ A FOTOMETRICKÁ ANALÝZA MATRIX GLA PROTEINU U PACIENTŮ S ONEMOCNĚNÍM POHYBOVÉHO APARÁTU

Význam tématu

Matrix Gla protein (MGP) je klíčový minerální inhibitor závislý na vitaminu K, který brání nežádoucí kalcifikaci měkkých tkání. Nedostatečná karboxylace a fosforylace tohoto proteinu přispívají k rozvoji heterotopické osifikace, kalcifikující tendinitidy a kardiovaskulárních onemocnění. Monitorování hladin MGP a jeho defosforylované a nekarboxylované formy (dp-uc MGP) může poskytnout cenné informace o stavu vitaminu K a riziku kalcifikace.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout a validovat spolehlivé imunochemické metody pro stanovení celkového MGP a dp-uc MGP v klinických vzorcích, aplikovat je na vzorky pacientů s poruchami pohybového aparátu a navázat na to chemickou analýzu hladin vitaminu K a biochemických markerů kostního metabolismu.

Použitá metodika a instrumentace

• Imunochemická stanovení MGP metodou ELISA (MyBioSource, USA) s měřením absorbance na Tecan Infinite při 540 nm.
• Automatizovaná detekce dp-uc MGP na analyzátoru IDS-iSYS (Immuno-diagnostic Systems) metodou CLIA.
• LC-MS/MS analýza vitaminu K1 a K2 (MK-7) pomocí Agilent 1290 Infinity II s Triple Quad 6470 a kolonou SB-C8, extrakce SPE.
• Biochemické stanovení Ca, P, ALP, kreatininu a 25-(OH) vitaminu D na analyzátorech Atellica Solutions CH 930 a IM (Siemens).

Hlavní výsledky a diskuse

• ELISA: linearita pro MGP až do 10 ng/ml (r=0,9968), LOD=1,6 ng/ml, LOQ=5,4 ng/ml, RSD 9,3 %.
• CLIA: kvadratická kalibrace dp-uc MGP do 15 000 pmol/l (r=0,995), LOD=105 pmol/l, LOQ=320 pmol/l, RSD 8,9 %.
• Průměrné hladiny celkového MGP v séru kontrol (n=29) byly 22,9 ng/ml, u pacientů (n=47) 30,2 ng/ml (p=0,2191). dp-uc MGP v kontrolách (n=29) průměr 2,5 ng/ml, u pacientů (n=12) 2,55 ng/ml (p>0,05).
• Distribuce koncentrací MGP a dp-uc MGP ukázala převážné hodnoty mezi 6–14 nmol/l a 2–3 ng/ml.
• Korelace: MGP s vitaminem D a ALP (r=–0,881), MK-7 s MGP (r=0,995), MGP s P (r=–0,894) a Ca (r=0,768). Negativní korelace mezi MGP a dp-uc MGP (r=–0,66).

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinuté metodiky vykazují vhodné analytické parametry a mohou být zařazeny do rutinní praxe klinických laboratoří pro hodnocení rizika kalcifikace měkkých tkání, monitorování závažnosti kloubních a kardiovaskulárních onemocnění a sledování statusu vitaminu K.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření testování na větší pacientské kohorty pro stanovení referenčních intervalů.
• Integrace MGP a dp-uc MGP do panelů biomarkerů pro kardiovaskulární riziko a osteoartrózu.
• Využití kombinované analýzy s obrazovými metodami (CT, MRI) pro přesnější diagnostiku heterotopické osifikace.
• Další vývoj imunochemických kitů pro zvýšení citlivosti a automatizace procesů.

Závěr

Byly vytvořeny a validovány imunochemické metody pro stanovení celkového MGP a dp-uc MGP s odpovídajícími analytickými charakteristikami. Pilotní aplikace na pacientských vzorcích prokázala možnosti klinického využití jako biomarkerů kalcifikačních procesů a statusu vitaminu K. Další práce se zaměří na větší soubory a rutinní implementaci.

Reference

1. Kotb MM, Omar UF, Kaliya-Perumal AK. Diagnostics. 2023;13:1711.
2. Klapkova E, Dunovska K, Kizek R, Hodik M, Ceppova J, Prusa R, Barna M, Melicharcik P. Motol In. 2023;15:16.
3. Olsen E, Endrizzi D, Stephenson M, Farraher S. Skeletal Radiol. 2021;50:973.
4. Dhollander O, McKee A, Houben R. Acta Orthop Belg. 2020;86:162.
5. Wilkinson JM, Stockley I, Hamer AJ, Barrington NA, Eastell R. J Orthop Res. 2003;21:529.
6. Ishihara C, Kushida K, Takahashi M, Ohishi T, Murata H, Nagano A, Goto S. Spinal Cord. 2000;38:211.
7. Bjorklund G, Svanberg E, Dadar M, Card DJ, Chirumbolo S, Harrington DJ, Aaseth J. Curr Med Chem. 2020;27:1647.
8. Luo GB, Ducy P, McKee MD, Pinero GJ, Loyer E, Behringer RR, Karsenty G. Nature. 1997;386:78.
9. Murshed M, Schinke T, McKee MD, Karsenty G. J Cell Biol. 2004;165:625.
10. Schurgers LJ, Cranenburg ECM, Vermeer C. Thromb Haemost. 2008;100:593.
11. Westenfeld R, et al. Am J Kidney Dis. 2012;59:186.
12. Saritas T, et al. Clin Kidney J. 2022;15:2300.
13. Vidula MK, et al. Am J Hypertens. 2022;35:393.
14. Schurgers LJ, Teunissen KJF, Knapen MHJ, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:1629.
15. Schurgers LJ, Teunissen KJF, Knapen MHJ, et al. Clin Chim Acta. 2005;351:131.
16. Cranenburg ECM, et al. J Thromb Haemost. 2011;9:1225.
17. Crintea A, Dutu AG, Constantin AM, et al. Biology-Basel. 2022;11:82.
18. Svestak M, Sporova L, Prochazkova J, et al. Chem Listy. 2011;105:622.
19. Hou FP, Sun SQ, Abdullah SW, et al. Anal Methods. 2023;15:2154.
20. Dunovska K, Klapkova E, Sopko B, Cepova J, Prusa R. PeerJ. 2019;7:e7695.
21. Hubaux A, Vos G. Anal Chem. 1970;42:849.
22. Klapkova E, Cepova J, Dunovska K, Prusa R. J Clin Lab Anal. 2018;32:e22381.
23. Shea MK, O'Donnell CJ, Hoffmann U, et al. Am J Clin Nutr. 2009;89:1799.
24. Cranenburg ECM, Koos R, Schurgers LJ, et al. Thromb Haemost. 2010;104:811.
25. Misra D, Booth SL, Crosier MD, et al. J Rheumatol. 2011;38:1960.
26. Lis K. Reumatologia. 2008;46:1.
27. Wei FF, et al. J Am Heart Assoc. 2019;8:e011960.
28. Schlieper G, et al. J Am Soc Nephrol. 2011;22:387.
29. Oikonomaki T, Papasotiriou M, Ntrinias T, et al. Int Urol Nephrol. 2019;51:2037.
30. Levy-Schousboe K, et al. Clin Kidney J. 2021;14:2114.