SIMULTÁNNÍ STANOVENÍ VITAMINŮ B1, B2 A B6 METODOU KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE S HMOTNOSTNÍ DETEKCÍ

Význam tématu

Vitaminy skupiny B hrají zásadní roli v energetickém metabolismu a nervové funkci. Jejich přesné stanovení v doplňcích stravy a potravinách je klíčové pro kontrolu kvality, dodržení legislativních norem a ochranu zdraví spotřebitelů. Zároveň metodické přístupy umožňují optimalizovat fortifikaci a sledovat stabilitu těchto látek ve výrobních procesech.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a validovat rychlou, citlivou a reprodukovatelnou metodu pro simultánní kvantifikaci vitaminů B1 (thiamin), B2 (riboflavin) a vitaminer B6 (pyridoxin, pyridoxal, pyridoxamin) v nápojích, šumivých tabletách a doplňcích stravy. Autoři shrnují známé metody HPLC-UV a LC-MS/MS a identifikují potřebu nízkých detekčních limitů a jednoduché přípravy vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: UHPLC Agilent 1260
• Detekce: triple quadrupolový hmotnostní spektrometr Agilent 6460 s ESI v pozitivním módu
• Kolona: Agilent ZORBAX RRHT SB-Aq 3,0 × 100 mm, 1,8 µm
• Mobilní fáze: voda + 25 mM HCOONH4 + 0,1 % HCOOH (A) a methanol + 25 mM HCOONH4 + 0,1 % HCOOH (B)
• Gradient: 0–5 min 5→60 % B, 5–6 min 60 % B, 6,1–7 min návrat na 5 % B
• Teplota kolony: 30 °C; objem injekce: 1 µl; doba analýzy: 10 min
• MRM přechody pro jednotlivé analyty byly optimalizovány pro selektivní detekci
• Příprava vzorku: kyselá hydrolýza s enzymem diastasy pro B1 a B2, enzymatická hydrolýza fosfatasou pro B6

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykázala:

• Vysokou linearitu v rozsahu 0,5–500 ng/ml pro všechny analyty
• Relativní standardní odchylky opakovatelnosti <2 % pro B1, B2 i vitaminy B6
• Výtěžnost extrakce mezi 88–96 % v závislosti na analytech
• Limity detekce v rozmezí 0,056–0,142 ng/ml a limity stanovitelnosti 0,168–0,426 ng/ml
• Nejistota měření v rozmezí 2,5–20 % (vyšší hodnoty u pyridoxinových vitaminer v důsledku složitějších hydrolytických kroků)
• Stabilita směsného standardu: vitamin B6 stabilní v citrátovém pufru pH 4,5, pyridoxal v demineralizované vodě klesá až o 32 % za 28 dní

Reálné vzorky prokázaly, že v drtivé většině případů jsou deklarované obsahy vitaminů na obalech splněny v legislativních tolerancích (+50/–20 % u doplňků, +50/–35 % u ostatních potravin). Výjimkou byl vzorek Additiva Multivitamin s velmi nízkým obsahem riboflavinu (3,1 % deklarované hodnoty).

Přínosy a praktické využití metody

• Krátký analytický čas (10 min) a nízké spotřeby eluentů
• Vysoká citlivost umožňující stanovení i velmi nízkých koncentrací
• Možnost simultánního stanovení pěti vitamérů B6 i dvou vitaminů B1 a B2 v rámci jediné analýzy
• Univerzální použití pro doplňky stravy, fortifikované potraviny, nápoje a přípravky pro děti
• Snížení rizika nedetekce destabilizovaných vitamínů při nesprávném skladování

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj LC-MS/MS metod směrem k minimalizaci preparativních kroků a rozšíření na vázané formy vitaminů v komplexních matricích (cereálie, masné výrobky). Integrace s automatizovanou online extrakcí a použití vysoce přesných QTOF detektorů zlepší schopnost sledovat metabolity a degradované produkty během výroby a skladování.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda pro simultánní stanovení vitaminů B1, B2 a B6 poskytuje robustní, rychlý a citlivý nástroj pro kontrolu kvality potravinářských produktů. Uplatnění nachází v laboratořích QA/QC, výzkumu a regulačním testování. Příští kroky budou zaměřeny na aplikaci na složitější potravinové matrice a validaci pro rutinní analýzu.

Reference

• Agilent Technologies: Quantitative Analysis of Water-Soluble B-Vitamins in Cereal Using Rapid Resolution LC/MS/MS. USA, 2008
• Agilent Technologies: Rapid, Sensitive and Cost-effective Detection of B Vitamins in Foods by UHPLC/MS/MS. UK, 2012
• Davídek J. et al.: Chemie potravin. SNTL/ALFA, Praha 1983
• Freed M. (ed.): Methods of Vitamin Assay. 3. vydání. Interscience Publishers, New York 1966
• Vyhláška č. 225/2008 Sb., požadavky na doplňky stravy a obohacování potravin, Sbírka zákonů 2008