VYUŽITÍ MONOLITICKÝCH KOLON PŘI VYSOKORYCHLOSTNÍ CHROMATOGRAFICKÉ SEPARACI BRAMBOROVÝCH INHIBITORŮ PROTEAS

Význam tématu

Analýza a separace bramborových inhibitorů proteas je klíčová pro pochopení jejich multifunkční role v obranných mechanismech rostlin, skladování proteinů a potenciálních farmaceutických aplikacích. Rychlé a efektivní chromatografické metody umožňují rychlejší izolaci cílových bílkovin při zachování jejich aktivity a struktury.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyhodnotit využitelnost monolitických iontově výměnných kolon UNO S6 a UNO Q6 v systému FPLC pro separaci bramborových inhibitorů proteas. Předtím byla molekulární směs z tuberinní šťávy předseparována na kolonách DEAE a Con A Sepharose 4B.

Použitá metodika a instrumentace

• Výchozí materiál: bramborová šťáva z odrůd Adéla (konzumní) a Eurostarch (průmyslová).
• Předčištění: gravitační chromatografie na mediích Iontosorb DEAE a Con A Sepharose 4B.
• Hlavní separace: systém BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 (Bio-Rad) s monolitickými kolonami UNO S6 (kationtová výměna) a UNO Q6 (aniontová výměna).
• Analýza frakcí: SDS-PAGE na 10–15% polyakrylamidových gelech a barvení Coomassie Brilliant Blue.

Hlavní výsledky a diskuse

• Dvoustupňové předčištění rozdělilo tuberinní proteiny do čtyř hlavních frakcí: bazické inhibitory, kyselé inhibitory a dvě frakce patatinového komplexu.
• Monolitická kolona UNO S6 rozčlenila bazické inhibitory proteas do 3–4 frakcí odpovídajících skupinám inhibitorů cysteinových, aspartátových a typu Kunitz.
• Kolona UNO Q6 umožnila separaci kyselých inhibitorů do 3–4 frakcí, přičemž majoritními složkami byly PI-2 a PI-1.
• SDS-PAGE potvrdila molekulové hmotnosti 8–20 kDa pro PIs a ~40 kDa pro patatiny.
• Monolitické kolony nabídly vyšší průtokové rychlosti bez zvýšení tlaku, což zkrátilo dobu analýzy při zachování rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlejší a účinnější separace proteinových frakcí s minimálním odpadním čase.
• Cílená izolace jednotlivých inhibitorů pro biochemické, farmaceutické a potravinářské aplikace.
• Vhodné pro studie antimikrobiální a antivirové aktivity i charakterizaci funkcí PIs.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace FPLC s hmotnostní spektrometrií pro detailní identifikaci izoform.
• Využití vysokoprůtokových monolitických nosičů v průmyslové purifikaci biopolymerů.
• Rozšíření nabídky monolitických kolon o speciální afinitní a speciální ligandy.

Závěr

Monolitické iontově výměnné kolony UNO S6 a UNO Q6 prokázaly vysokou efektivitu v separaci bazických i kyselých bramborových inhibitorů proteas. Kombinace s gravitačním předčištěním zajistila vysokou čistotu, zachování aktivity a významné zkrácení doby analýzy, což rozšiřuje možnosti aplikace v analytické chemii a biochemii.

Reference

• Fagerstam L. G., Lizana J., Axiö-Fredriksson U. B., Wahlström L.: J Chromatogr. 266, 523 (1983).
• Madadlou A., O’Sullivan R., Sheehan D.: Methods Mol. Biol. 681, 439 (2011).
• Vojta J., Musilová-Svobodová A., Franc M., Coufal P., Bosáková Z.: Chem. Listy 108, 127 (2014).
• Ali I., Vinay D. G., Aboul-Enein H. Y.: J. Chromatogr. Sci. 47, 432 (2009).
• Švec F.: Chem. Listy 98, 232 (2004).
• Lawrence P. K., Koundal K. R.: J. Biotechnol. 5, 93 (2002).
• Pouvreau L.: Dissertation. Wageningen University, Wageningen, Nizozemsko, 2004.
• Fischer M., Kuckenberg M., Kastilan R., Muth J., Gebhradt C.: Mol. Genet. Genomics 290, 387 (2015).
• Kim J. Y., Park S. C., Hwang I., Cheong H., Nah J. W., Hahm K. S., Park Y.: Int. J. Mol. Sci. 10, 2860 (2009).
• Feldman M. L., Andreu A. B., Korgan S., Lobato M. C., Huarte M., Walling L. L., Daleo G. R.: Plant Breed. 133, 275 (2014).
• Lima A. I. G., Mota J., Monteiro S. A. V. S., Ferreira R. M. S. B.: Food Chem. 197, 30 (2016).
• Fan S. G., Wu G. J.: Bot. Bull. Acad. Sin. 46, 273 (2005).
• Racusen D., Foote M.: J. Food Biochem. 4, 43 (1980).
• Bártová V., Bárta J.: J. Agric. Food Chem. 57, 9028 (2009).
• Laemmli U. K.: Nature 227, 680 (1970).
• Bártová V., Bárta J., Kamenová A., Staňková A., Čurn V.: Chem. Listy 106, 365 (2012).
• Beekwilder J., Schipper B., Bakker P., Bosch D., Jongsma M.: Eur. J. Biochem. 267, 1975 (2000).
• Nissen M. S., Kumar G. N. M., Youn B., Knowles D. B., Lam K. S., Ballinger W. J., Knowles N. R., Kang C.: Plant Cell 21, 861 (2009).