A Semi-Automated Method for Sequencing Oligonucleotides using ISD and Pseudo-MS3 on a MALDI-Ion Trap-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Správné určení sekvence oligonukleotidů je klíčové v biotechnologii, farmaceutickém vývoji i analýze terapeutických RNA konstruktů. Modifikace, jako 2’-O-metyl fosforotioát, zvyšují stabilitu, ale mohou ztížit konvenční hmotnostní stanovení. Využití MALDI-Ion Trap-TOF v režimu in-source decay (ISD) nabízí vysokou hmotnostní přesnost a monizotopní rozlišení, což umožňuje detailní mapování fragmentů a polomanažérskou automatizaci vyhodnocení.

Cíle a přehled studie

Studie představuje semiautomatizovaný workflow pro sekvenování modifikovaných oligonukleotidů založené na MALDI-ISD a pseudo-MS3. Hlavním cílem bylo ukázat, že software původně vyvinutý pro analýzu kopolymerů lze adaptovat k iterativnímu určování složení a pořadí nukleotidů v krátkých oligořetězcích (do ~20 merů).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky oligonukleotidů byly desaltovány na Dowex 50WX8-200 a připraveny v matrici 3-hydroxypikolínová kyselina s ammoniovým citrátem. Hromadové spektry a ISD fragmenty byly zaznamenány v Mid 850 režimu na přístroji AXIMA Resonance MALDI-Ion Trap-TOF. Laserová energie byla zvýšena o 10 % oproti běžnému MS, každá analýza házela 500–800 profilů po dvou laserových pulzech.

Použitá instrumentace

• MALDI-Ion Trap-TOF spektrometr AXIMA Resonance (Shimadzu)
• Matrici HPA s ammoniovým citrátem
• Dowex 50WX8-200 ionex-desaltační pryskyřice
• Software Polymer Analysis pro semiautomatizované vyhodnocení

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda byla otestována na třech 2’-O-me- fosforotioát modifikovaných RNA vzorcích. U dvou vzorků bylo dosaženo 100% korektního určení pořadí (20/20 a 21/21 nukleotidů), třetí vzorek vykazoval 80% správnost (16/20), přičemž prostřední dvě pozice zůstaly nerozlišené vzhledem k nízké intenzitě fragmentů. Pseudo-MS3 analýza terminálních ISD produktů potvrdila pořadí po přidání jedné báze, což umožnilo přesnou orientaci 5’- a 3’- konců.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší hmotnostní přesnost a rozlišení oproti lineárnímu režimu MALDI-TOF.
• Možnost potvrdit terminální sekvence pomocí pseudo-MS3.
• Semiautomatizované vyhodnocení zkracuje dobu analýzy a snižuje chybovost.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na plnou automatizaci sekvenčního workflow, implementaci pravidel pro vyloučení nepraktických kombinací a zvýšení rozsahu analyzovaných oligořetězců nad 20 merů. Zvýšení citlivosti a dostupnost vyšší hmotnostní přesnosti by mohly umožnit sekvenování složitějších i dlouhých modifikovaných RNA a DNA fragmentů.

Závěr

Popsaná metoda kombinuje výhody MALDI-Ion Trap-TOF ISD a semi-automatizovaného softwarového zpracování. Ukazuje se jako efektivní přístup pro rychlé a spolehlivé určení sekvence krátkých modifikovaných oligonukleotidů. I když je nutná další optimalizace pro vyšší oligomery, tato práce demonstruje silný potenciál technologie pro kvalitativní kontrolu terapeutických RNA.

Reference

Žádné specifické reference uvedeny.