High-Sensitivity Analysis of a Steroid Panel Samples using Micro-Flow LC-MS/MS for Clinical Research

Význam tématu

Steroidy hrají klíčovou roli v řadě fyziologických procesů, včetně hormonální regulace, metabolismu a odpovědi na stres. Kvantifikace nízkých koncentrací reprodukčních hormonů v krevním séru, zejména u pediatrických nebo postmenopauzálních vzorků, je náročná kvůli omezenému objemu vzorku a velmi nízkým hladinám cílových analytů. Vývoj vysoce citlivých metod pro současné měření steroidního panelu má zásadní význam pro klinický výzkum a diagnostiku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout a validovat mikroprůtokovou LC-MS/MS metodu schopnou simultánně kvantifikovat sedmnáct klíčových steroidů v lidském séru s dolní mezí kvantifikace (LOQ) až 0,1 pg/mL. Hlavními požadavky byly dosažení vysoké citlivosti, selektivity pro izobarické sloučeniny a minimalizace spotřeby vzorku.

Použitá metodika

Reagencie a vzorky

• Standardy 17 steroidů a tří deuterovaných interních standardů.
• Charcoal-stripped séra pro kalibraci a kontrolu kvality.

Příprava vzorku

• 300 µL séra doplněno 30 µL ISTD (500 pg/mL).
• Podporovaná tekutá extrakce (SLE) se směsí ethylacetátu/hexanu (75/25).
• Suchá extrakce a rekonstituce v 50 µL methanolu.

Chromatografie

• Trapping-fáze: C8 CERI 5×0,3 mm, průtok 200 µL/min, gradient z vody/methanolu na acetonitril/isopropanol.
• Analytická fáze: biphenylová kolona 100×0,2 mm, teplota 50 °C, průtok 4 µL/min, gradient metanolu s NH4F.

Použitá instrumentace

LC-MS/MS systém

• Vysokocitlivý triple quadrupolový hmotnostní spektrometr LCMS-8060 (Shimadzu).
• Micro-ESI zdroj, napětí +1,8 kV / –2,8 kV, teploty interface 150 °C, desolvation line 250 °C, block 300 °C.
• LC Mikros systém s trap-and-elute konfigurací: čerpadla LC-Mikros, LC-30AD, autosampler SIL-30AC, přepínací ventil FCV-32AH, kolonaž CTO-Mikros.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla LOQ v rozmezí 0,1–10 pg/mL (odpovídá 6 fg na kolonu) pro jednotlivé steroidy. Kalibrační křivky vykázaly lineární odezvu (váhování 1/x2) s přesností 80–120 % (80–120 % u LOQ) a reprodukovatelností (%RSD) pod 20 %. Separace izobarických složek zabránila kvantifikačnímu zkreslení. Nízké LOQ umožňují analýzu vzorků s omezenou dostupností a nízkými hladinami hormonů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda podporuje výzkum a monitorování endokrinních poruch, farmakokinetické studie a environmentální biomonitoring. Mikroprůtoková LC-MS/MS šetří vzorek i činidla a zlepšuje citlivost oproti konvenčním protokolům.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší implementace mikroprůtokových technik ve klinické praxi a farmaceutickém výzkumu. Integrace s vysokopropustným zpracováním a automatizovanými platformami může dále zvýšit objem vzorků a efektivitu. Rozšíření panelu o další steroidy a konjugáty posílí diagnostickou hodnotu.

Závěr

Vyvinutá mikroprůtoková LC-MS/MS metoda pro analýzu sedmnácti steroidů v lidském séru dosahuje vynikající citlivosti, přesnosti a reprodukovatelnosti. Umožňuje spolehlivou kvantifikaci i v omezených objemech vzorku a nízkých koncentracích, což představuje významný pokrok pro klinický výzkum.

Reference

• Shirai N., Hattori T., Levi M., Nakayama S.F., Suzuki S. High-Sensitivity Analysis of a Steroid Panel Samples using Micro-Flow LC-MS/MS for Clinical Research. Shimadzu WP219.