Increasing Chromatographic Performance of Acidic Peptides in RPLC-MS-based Assays with ACQUITY PREMIER featuring MaxPeak HPS Technology

Význam tématu

Interakce peptidů s kovovými povrchy v RPLC-MS metodách může vést ke špatnému tvaru píků, výraznému tailingu a nižší návratnosti analytů. Tyto jevy negativně ovlivňují citlivost, reprodukovatelnost a kvalitu dat, což je kritické zejména při analytice biotechnologických léčiv, kde se často pracuje s peptidy obsahujícími kyselé zbytky.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat schopnost kolonek ACQUITY PREMIER s technologií MaxPeak HPS omezit kovem zprostředkované adsorpce peptidů a zlepšit chromatografické vlastnosti peptidových map RPLC-MS. Testy proběhly na standardu tryptického digestu NIST mAb a sadu syntetických peptidů obsahujících až čtyři kyselé zbytky.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Waters mAb Tryptic Digestion Standard (NIST mAb).
Kolonky: ACQUITY CSH 130 Å C18 vs ACQUITY PREMIER Peptide CSH 130 Å C18 s MaxPeak HPS.
LC systémy: ACQUITY UPLC H-Class Binary Bio PLUS.
MS detekce: ACQUITY QDa (ESI+, 250–1250 m/z), SYNAPT XS (ESI+, 50–2000 m/z).
Software: Empower 3, MassLynx 4.2, UNIFI 1.9.4.
Kolonka byla provozována při 60 °C, mobile phase A (voda/0,1 % FA), B (ACN/0,1 % FA), průtok 0,2 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Syntetické peptidy s 0–4 kyselými zbytky vykazovaly s běžnou CSH kolonou významný tailing, zatímco s MaxPeak HPS byl tailing minimalizován.
2. Peptid ‘‘PENNYK’’ (T37) s 4 kyselými zbytky při běžné koloně měl tailing 5,53, což znemožnilo detekci deamidovaných příbuzných látek; s technologií MaxPeak HPS byl tailing snížen o 79 % na 1,15 a separace deamidací byla úspěšná.
3. Peptid T14 v NIST mAb digestu nebyl při 0,2 µg detekován na běžné koloně (90 % pokrytí sekvence), ale s PREMIER kolonou se zvýšila návratnost a pokrytí na 94 %.
4. U peptidu T37 došlo k 10násobnému nárůstu výšky píku a 4násobnému zvýšení plochy, při 90 % snížení RSD výšky signálu.
5. MSE fragmentace ukázala jasné rozlišení a přiřazení deamidací a succinimidových meziproduktů.
6. Po dobu 48 h byla s technologií MaxPeak HPS zachována stabilní reproducibilita píků (%RSD tailingu 1,01 %), zatímco u konvenční technologie došlo k nárůstu variability (%RSD 8,87 %).
7. Komparabilita s existujícími metodami potvrdila, že MaxPeak HPS nezměnila selektivitu a retence peptidů (směrnice 1,00; offset −0,005).

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost díky lepší návratnosti a sníženému tailingu.
• Kompatibilita s existujícími metodami bez potřeby doplňkových přísad.
• Zvýšená robustnost a reprodukovatelnost analýz.
• Zrychlení vývoje metod a zvýšení produktivity laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší aplikace technologie MaxPeak HPS v biotechnologické a farmaceutické analýze pro peptidové a proteinové metody, včetně QC výrobních procesů. Další rozvoj může zahrnovat optimalizaci povrchových úprav pro jiné třídy analytů a integraci s automatizovanými platformami.

Závěr

Technologie MaxPeak HPS v kolonkách ACQUITY PREMIER významně redukuje kovem zprostředkovanou adsorpci peptidů, zlepšuje tvar píků, návratnost i reprodukovatelnost RPLC-MS metod. Umožňuje přesné a robustní stanovení kyselých peptidů bez dodatečných přísad či rozsáhlých passivačních procedur.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Binary Bio PLUS
• ACQUITY PREMIER Peptide CSH 130 Å C18 Column
• ACQUITY CSH 130 Å C18 Column
• ACQUITY QDa Mass Detector
• SYNAPT XS High Resolution Mass Spectrometer
• Empower 3 FR4
• MassLynx 4.2
• UNIFI 1.9.4

Reference

1. Giddings JC, Eyring H. A Molecular Dynamic Theory of Chromatography. J. Phys. Chem. 1955;59:416–421.
2. Fornstedt T, Zhong G, Guiochon G. Peak Tailing and Nonlinear Mass Transfer Kinetics in Chromatography. J. Chromatogr. A 1996;742:55–68.
3. Fornstedt T, Zhong G, Guiochon G. Peak Tailing and Mass Transfer Kinetics in Linear Chromatography. J. Chromatogr. A 1996;741:1–12.
4. Lauber M et al. Low Adsorption LC Technology Based on MaxPeak High Performance Surfaces. Waters White Paper 720006930EN 2020.
5. Birdsall R, Kellett J, Yu YQ, Chen W. Mobile Phase Additives to Reduce Metal-ion Mediated Adsorption of Non-phosphorylated Peptides in RPLC-MS Assays. J. Chromatogr. B 2019;1126–1127:121773.