Analysis of Microcystins in Urine with 2D-LC-MS/MS – Part III

Význam tématu

V posledních desetiletích se častěji objevují tzv. „superkvěty“ sinic ve sladkých vodách, které vedou k uvolňování toxických cyanopeptidů – zejména mikrocytinů.
Tyto látky představují závažné riziko pro zdraví lidské populace i živočichů, protože jsou stabilní vůči slunečnímu záření, teplotním výkyvům a širokému pH rozmezí.
Detekce mikrocytinů v biologických vzorcích, jako je moč, je klíčová pro environmentální monitorování, toxikologii i forenzní chemii.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem předložené studie bylo vyvinout robustní, rychlou a citlivou metodu pro stanovení tří nejčastějších variant mikrocytinů (LR, RR, YR) v moči.
Analýza využívá dvoudimenzionální kapalinovou chromatografii (2D-LC) v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (MS/MS).
Studie se zaměřila na optimalizaci extrakčního protokolu i chromatografických podmínek v rámci rozsáhlé matice 6×6 permutací.

Použitá metodika a instrumentace

Pro čištění a koncentraci vzorku byla použita kavitační extrakce na SPE sloupcích Oasis HLB (3 cc, 60 mg).
Chromatografická separace probíhá na systému ACQUITY UPLC s 2D technologií (trap-and-elute) a kolonkou BEH C18 (1,7 µm, 2,1×50 mm).
Analýzu zajišťuje Xevo TQ-S MS s ESI v pozitivním režimu, detekční režim MRM s dvěma přechody pro kvantifikaci a potvrzení každého analyta.
Optimalizace probíhala automatizovaně: pH elučních fází (3, 7, 10) a typ organických rozpouštědel (ACN, MeOH) pro oba dimenze.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC systém s 2D technologií (trap-and-elute, at-column dilution)
• ACQUITY UPLC BEH C18 kolonka, 1,7 µm, 2,1×50 mm
• Oasis HLB SPE cartrdidge (3 cc, 60 mg)
• Xevo TQ-S tandemový hmotnostní spektrometr
• Standardy mikrocytinů od Enzo Lifesciences

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace 6×6 chromatografických podmínek odhalila nejvhodnější konfiguraci (metoda č. 14) zajistí ostré, symetrické eluce všech analyzovaných cyklických peptidů.
Možnost velkoobjemové injekce (100 µL 100% organického extraktu) díky at-column dilution zkrátila dobu přípravy vzorků pod 30 min a eliminovala nutnost odpařování.
SPE protokol byl z finálního screeningu modifikován: dva promývací kroky (40% MeOH při pH 3 a 40% MeOH při pH 10) a konečná eluce 70% MeOH při pH 10 přinesly průměrné recovery 89–95% pro YR, LR a RR v moči.
Rozdílné chování mikrocytinů v závislosti na koncentraci organického rozpouštědla (MeOH, ACN, acetonu) upozornilo na potenciální izolační artefakty při používání 100% ACN.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý protokol s celkovou dobou extrakce a analýzy pod 30 min
• Vysoká selektivita a citlivost díky MRM přechodům
• Eliminace časově náročného odpařování a rekonstituce vzorků
• Vhodné pro forenzní, toxikologické i environmentální laboratoře
• Možnost aplikace na screening řady cyanopeptidů

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je rozšíření panelu analyzovaných toxinů (anatoxin-A, cylindrospermopsin) a integrace do plně automatizovaných pracovních stanic.
Vývoj miniaturizovaných 2D-LC modulů pro terénní aplikace a real-time monitoring sinicových květů ve vodních tocích.
Využití strojového učení při optimalizaci chromatografických metod a při predikci chování peptidických toxinů.

Závěr

Vyvinutá 2D-LC-MS/MS metoda s captive SPE extrakcí prokazuje rychlou a robustní analýzu tří klíčových mikrocytinů v moči.
Metoda nabízí vysoké recoveries, zkrácenou přípravu vzorků a vynikající selektivitu, což ji činí vhodnou pro rutinní i forenzní použití.

Reference

1. Theiss W.W.; Carmichael J.; Wyman J.; Brunner R. Blood Pressure and Hepatocellular Effects of the Cyclic Heptapeptide Toxin Produced by Freshwater Cyanobacterium Micocystis Aeruginosa PCC-7820. Toxicon. 1988, 26, 603–613.
2. Runnegar M.T.C.; Andrews J.; Gerdes R.G.; Falconer I.R. Injury to Hepatocytes Induced by Peptide Toxin from the Cyanobacterium Microcystis Aeruginosa. Toxicon. 1987, 25, 1235–1239.
3. Gupta S. WHO Guidelines for Drinking Water Quality. WHO, Geneva 1998, p. 36.
4. Codd G.A.; Poon G.K. Biochemistry of the Algae and Cyanobacteria. Clarendon Press, Oxford 1988, p. 283.
5. Rapala J.; Erkomaa K.; Kukkonen J.; Sivonen K.; Lahti K. Detection of Microcystin with Protein Phosphatase Inhibition Assay, HPLC-UV, and ELISA. Anal. Chim. Acta. 2002, 466, 213–231.
6. Fischer W.J.; Garthwaite J.; Miles C.O.; Ross K.M.; Aggen J.B.; Chamberlin A.R.; Towers N.R.; Dietrich D.R. Congener-Independent Immunoassay for Microcystins and Nodularins. Environ. Sci. Technol. 2001, 35, 4849–4856.
7. Zhang L.; Ping X.; Yang Z. Determination of Microcystin LR in Surface Water Using HPLC/ESI-MS. Talanta. 2004, 62, 196–200.
8. Mila M.; William L.B. A LC/MS Method for Determination of Cyanobacteria Toxins in Water. Anal. Chem. 2004, 76, 1342–1352.
9. Mallet C.R.; Botch-Jones S. Illicit Drug Analysis Using Two-Dimensional LC/MS. J. Anal. Toxicol. 2016, 40(8), 1–11.
10. Mallet C.R. Multi-Dimensional Chromatography Compendium: Trap & Elute vs At-column Dilution. White Paper, Waters Corp. 2015.
11. Mallet C.R. Analysis of Pharmaceuticals and Pesticides in Water Using ACQUITY UPLC 2D Technology. App. Note, Waters Corp. 2014.
12. Hyenstrand P.; Metcalf J.S.; Beattie K.A.; Codd G.A. Effects of Adsorption to Plastics and Solvent Conditions in Microcystin-LR Analysis by HPLC. Water Res. 2001, 35(14), 3508–3511.