Antibody-Drug Conjugate (ADC) Drug-to-Antibody Ratio (DAR) Analysis in Serum Using IA-LC-HRMS

Význam tématu

Antibody-Drug Conjugáty (ADC) představují cílená bioterapeutika složená z monoklonální protilátky napojené na cytotoxickou molekulu. Poměr počtu léčiva k protilátce (DAR) patří mezi kritické kvality ovlivňující účinnost, distribuci a bezpečnost ADC. Spolehlivá analýza DAR v biologických matricích umožňuje přesné sledování biotransformace a farmakokinetického profilu

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje metodiku IA-UPLC-HRMS pro kvantifikaci a kvalitativní profil DAR u ADC T-DM1 (ado-trastuzumab emtansine) v myším séru. Cílem bylo zajistit citlivé, lineární a opakovatelné měření DAR jednotlivých konjugátů v rozmezí relevantních koncentrací a ověřit stabilitu metody

Použitá metodika a instrumentace

Imunopurifikace ADC probíhá na streptavidinem potažených magnetických kuličkách a biotinylovaném antigenovém úlovku HER2. Eluce T-DM1 je prováděna kyselou vodnou směsí s acetonitrilem. Chromatografická separace se odehrává na systému ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio FTN s kolonkou Protein BEH C4 (2.1×50 mm, 1.7 µm, 300 Å) za použití gradientu 0.1 % kyseliny mravenčí ve vodě a acetonitrilu. Detekce je zajištěna vysoce rozlišovacím spektrometrem Xevo G2-XS QTof v režimu ESI+ a pro zpracování dat slouží softwarové prostředí UNIFI včetně dekonvolučního algoritmu MaxEnt1

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogram T-DM1 vykázal retenční čas přibližně 5.4 minuty s mírným protažením špičky u vysoce navázaných DAR. MS spektrum obsahovalo náboje 70+ až 40+ kolem m/z 2700–3000. Dekonvoluce odhalila distribuci DAR od 0 do 8, přičemž nejvyšší zastoupení měly DAR3 a DAR4. Lineární kalibraci pro koncentrace 5–100 µg/mL potvrdilo dobrou přesnost a opakovatelnost (r2>0.99) i při nejnižším bodu. Metoda umožnila detekci hlavních DAR i v 5 µg/mL a vykázala stabilní průměrný DAR (~3.5) během 120hodinové inkubace v pufru i séru

Přínosy a praktické využití metody

IA-UPLC-HRMS doplňuje ELISA o detailní pohled na jednotlivé DAR specii a glykoformy ADC. Metoda je vhodná pro preklinické i klinické PK/PD studie, vývoj generik a kontrolu kvality farmaceutických přípravků založených na ADC

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace multi-dimenzionální chromatografie a ion mobility pro lepší separaci heterogenních konjugátů
• Automatizované imunoprůběhové přípravy a vysokopropustné platformy pro screening DAR v klinických vzorcích
• Využití strojového učení pro zrychlení dekonvoluce a predikci biotransformačních produktů
• Rozšíření aplikace na nové generace linkerů a různé typy nábojů ADC

Závěr

Metoda IA-UPLC-HRMS pro analýzu DAR ADC v séru prokázala vysokou citlivost, linearitu a reprodukovatelnost i při nízkých koncentracích. UNIFI software zjednodušuje automatické výpočty DAR a dekonvoluci spekter. Celkově tato přístupná platforma zvyšuje kvalitu PK/PD vyhodnocení a podporuje vývoj nových ADC terapií

Reference

• Mou S, Huang Y, Rosenbaum AI. ADME Considerations and Bioanalytical Strategies for Pharmacokinetic Assessments of Antibody-Drug Conjugates. Antibodies. 2018;7:41.
• Dere R, Yi J-H, Lei C. PK Assays for Antibody–Drug Conjugates: Case Study with Ado-Trastuzumab Emtansine. Bioanalysis. 2013;5(9):1025–1040.
• Kellie JF, Karlinsey MZ. Review of Approaches and Examples for Monitoring Biotransformation in Protein and Peptide Therapeutics by MS. Bioanalysis. 2018;10(22):1877–1890.
• Gorovits B, Alley SC, Bilic S, et al. Bioanalysis of Antibody–Drug Conjugates: AAPS ADC Working Group Position Paper. Bioanalysis. 2013;5(9):997–1006.