Determination of Fat-Soluble Vitamins in Infant Formula Using Agilent Bond Elut Plexa Polymeric SPE with HPLC and LC/MS/MS

Význam tématu

Správná kvantifikace rozpustných vitamínů A, D a E v dětské výživě je zásadní pro zdravotní bezpečnost kojenců. Tyto vitamíny se hromadí v těle a nadměrný či naopak nedostatečný obsah může vést k závažným zdravotním komplikacím. Vývoj rychlých, citlivých a reprodukovatelných metod je klíčový pro průmyslovou kontrolu kvality a dodržování legislativních limitů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo navrhnout a validovat jednoduchý a robustní analytický postup pro simultánní stanovení vitamínů A, D2, D3 a forem vitamínu E v práškové dětské výživě. Pro vitamin A a E byl použit HPLC s diodovým polem detekce (DAD), pro vitamíny D2 a D3 LC-MS/MS. Před chromatografií byl vzorek podroben saponifikaci a očištění polymerním SPE na Agilent Bond Elut Plexa.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku:

• Saponifikace: práškovou formuli promíchání s vodou, etanolem, KOH, askorbovou kyselinou, BHT při 80 °C pod proudem N₂.
• Čištění: Agilent Bond Elut Plexa SPE kartridž (200 mg, 6 mL) – kondicionace MeOH/voda, naložení, mytí vodou a 80/20 MeOH/voda, eluace acetonem, odpaření a rekonzitituce v MeOH.

Instrumentace:

• HPLC-DAD: Agilent 1290 Infinity II LC, InfinityLab Poroshell 120 PFP kolona 2.1×100 mm, DAD detekce při 325 nm (vitamin A) a 294 nm (vitaminy E).
• LC-MS/MS: Agilent 1290 Infinity II LC + 6470A Triple Quad s Jet Stream ESI, InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 kolona 2.1×100 mm.
• Další vybavení: dusíkový evaporátor, Vac Elut 20 manifold, sonikační lázeň, Captiva RC filtr.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografická separace vitamínů A/E dosáhla baseline rozlišení jednotlivých forem α, β, γ a δ vitamínu E a retinolu.
• Citlivost LC-MS/MS spojená s mobilní fází obohacenou o 4.5 mM amonného formiátu a 0.5 mM amonného fluoridu významně zvýšila intenzitu signálu pro vitaminy D2/D3 (nárůst 50–70× oproti formic acid only).
• Kalibrační křivky HPLC-DAD: 0.05–200 µg/mL, R² > 0.999; LC-MS/MS: 1–1000 ng/mL, R² > 0.998.
• Obnova (recovery) 81.2–97.3 %, opakovatelnost RSD < 10 % pro všechny analyty.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí nízkonákladové a jednoduché zpracování vzorku, vysokou reprodukovatelnost a široké dynamické rozsahy pro různé vitaminy. Je vhodná pro rutinní kontroly kvality v potravinářském průmyslu i regulované laboratoře QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorku a mikro-sPE pro nižší objemy rozpouštědel.
• Nasazení zelených rozpouštědel a udržitelných technologií.
• Rozšíření metody na další matice (mléčné výrobky, potravinové doplňky).
• Integrace s vysokorychlostními MS detektory pro širší vitaminové profily.

Závěr

Popsaný postup pro stanovení vitamínů A, D2, D3 a E v dětské výživě je ověřený, citlivý a reprodukovatelný. Kombinace saponifikace, polymerního SPE a dvou chromatografických platforem zajišťuje kvalitní výsledky s minimem mezních zásahů.

Reference

1. Michael F. H. et al. The Vitamin D Content of Fortified Milk and Infant Formula. N. Engl. J. Med. 1992, 326, 1178–1181.
2. Alfred S. Vitamin A Deficiency. 2001.
3. Ronald J. S. et al. Vitamin E Deficiency with Normal Serum Vitamin E Concentrations in Children with Chronic Cholestasis. N. Engl. J. Med. 1984, 310, 1209–1212.
4. Guideline for Vitamin A & D Fortification of Fluid Milk, Dairy Practices Council.
5. Yuan Z. et al. A Review of the Extraction and Determination Methods of Thirteen Essential Vitamins. Molecules 2018, 23, 1484–1509.
6. Muhammad I. K. et al. Optimization and Validation of RP-LC/UV-VIS Method for Simultaneous Determination of Fat-Soluble Antioxidant Vitamins. Chromatographia 2010, 71, 577–586.
7. Barakat I. S. A. et al. Simultaneous Determination of Vitamins A and D3 in Dairy Products by LC-MS/MS. IOP Conf. Ser.: Mater. Sci. Eng. 2015, 92, 012020.
8. Xiuping X. et al. Simultaneous Determination of Five Fat-Soluble Vitamins in Feed by HPLC Following SPE. J. Chromatogr. Sci. 2008, 46, 345–350.
9. SRM 1849a Infant/Adult Nutritional Formula I; SRM 1869 Infant/Adult Nutritional Formula II, NIST.
10. GB 5009.82-2016 Chinese Regulation Method for Vitamins A, D and E in Food.
11. Rodas M. B. et al. Rapid Determination of Vitamins A and E in Infant Formulas by RPLC. J. Chromatogr. A 2003, 1018, 197–202.
12. Kienen V. et al. Green Chromatographic Method for Fat-Soluble Vitamins in Food. Talanta 2008, 75, 141–146.
13. Chen L. et al. Determination of Fat-Soluble Vitamins Using Packed-Fiber SPE. Procedia Environ. Sci. 2011, 8, 588–595.