UPLC-MS/MS Determination of GLP-1 Analogue, Liraglutide A Bioactive Peptide in Human Plasma

Význam tématu

Glukagon-like peptid-1 (GLP-1) je endogenní hormon s klíčovou rolí v regulaci sekrece inzulínu, potlačování chuti k jídlu a glykemické homeostáze. Kvůli ultra­krátkému poločasu (1–2 min) se vyvinuly analogy s prodlouženou stabilitou a farmakokinetikou, jako je liraglutid (Victoza®), využívaný v léčbě diabetu 2. typu. Pro podporu vývoje a monitorování těchto terapeutik je nezbytné mít vysoce citlivé a selektivní analytické metody pro kvantifikaci v lidské plazmě.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo navrhnout a ověřit rychlou, robustní a vysoce senzitivní UPLC-MS/MS metodu pro stanovení liraglutidu v lidské plazmě v nízkých koncentracích (LLOQ 0,5 ng/mL). Studie popisuje optimalizaci přípravy vzorku, separace i hmotnostně­spektrometrické detekce a hodnotí výkonnost metody podle bioanalytických směrnic.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek plazmy (300 µL) byl přecen k odstranění bílkovin acetonitrilem a vodou, poté po centrifugaci následovala extrakce na Oasis WAX µElution destičce (96 jamková), využívající kombinované reverzní fáze a slabou aniontovou výměnu. Eluce proběhla bez nutnosti vytváření suchého zbytku. Chromatografie se prováděla na ACQUITY UPLC I-Class systému s kolonkou Peptide BEH C18 (300 Å, 1,7 µm, 2,1×150 mm) při 80 °C; mobilní fáze A: 0,3 % kyselina mravenčí ve vodě, B: acetonitril:methanol (50:50), lineární gradient, průtok 0,3 mL/min, cyklus 8 min. MS detekce proběhla na Xevo TQ-XS ve pozitivním režimu ESI a MRM přenosu z 4+ iontu (938,68 m/z) na fragment (1064,08 m/z).

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje LLOQ 0,5 ng/mL s poměrem signál/šum >126 a šířkou píků <8 s. Kalibrační křivka v rozsahu 0,5–200 ng/mL vykazovala vynikající linearitu (r2>0,995), přesnost 85–115 % a precizitu CV ≤15 %. QC vzorky (nízké, střední a vysoké koncentrace) potvrdily reprodukovatelnost (přesnost 93–106 %, CV ≤9 %). SPE v µElution formátu zajistilo vysokou výtěžnost a selektivitu bez ztrát na adsorpci.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost kvantifikace liraglutidu z nízkého objemu plazmy (300 µL).
• Vysoká citlivost a selektivita pro bioanalytické studie, farmakokinetiku a vývoj biosimilars.
• Rychlá throughput s 8min cyklem na vzorek a jednoduchou přípravou extrakcí bez evaporace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření LC-MS/MS metod na další peptidové a bílkovinné léky, implementace mikroflow UPLC a pokročilých MS analyzátorů pro vyšší citlivost. Automatizace SPE postupů a integrace mikrofluidických platforem mohou dále zrychlit analýzy a umožnit multiplexní stanovení více analogů GLP-1.

Závěr

Navržená SPE-UPLC-MS/MS metoda pro stanovení liraglutidu v lidské plazmě nabízí výjimečnou citlivost, linearitu a robustnost. Jednoduchá příprava vzorku a efektivní instrumentace podporují její využití ve výzkumu, vývoji a klinické farmakokinetice.

Reference

1. Novo Nordisk A/S. Victoza® Package Insert. 2010.
2. Malm-Erjefalt M, Bjørnsdottir I, Vanggaard J, Helleberg H, Larsen U, Oosterhuis B, van Lier JJ, Zdravkovic M, Olsen AK. Metabolism and Excretion of the Once-Daily Human GLP-1 Analogue Liraglutide in Healthy Male Subjects and Its In Vitro Degradation by Dipeptidyl Peptidase IV and Neutral Endopeptidase. Drug Metab Dispos. 2010;38(12):1944–1953.
3. Russell-Jones D. Molecular, Pharmacological and Clinical Suspects of Liraglutide, a Once-Daily Human GLP-1 Analogue. Mol Cell Endocrinol. 2009;297:137–140.
4. Gault VA, Kerr BD, Harriot P, Flatt PR. Administration of an Acylated GLP-1 and GIP Preparation Provides Added Beneficial Glucose-Lowering and Insulinotropic Actions Over Single Incretins in Mice with Type 2 Diabetes and Obesity. Clin Sci. 2011;121(3):107–117.
5. Jacobsen LV, Hindsberger C, Robson R, Zdravkovic M. Effect of Renal Impairment on the Pharmacokinetics of the GLP-1 Analogue Liraglutide. Br J Clin Pharmacol. 2009;68(6):898–905.
6. Garber A, Henry RR, Ratner RE, Garcia-Hernandez PA, Rodriguez-Pattzi H, Olvera-Alvarez I, Hale PM, Zdravkovic M, Bode BW. Liraglutide Versus Glimepiride Monotherapy for Type 2 Diabetes (LEAD-3 Mono). Lancet. 2009;373(9662):473–481.
7. Plum A, Jensen LB, Kristensen JB. In Vitro Protein Binding of Liraglutide in Human Plasma Determined by Reiterated Stepwise Equilibrium Dialysis. J Pharm Sci. 2013;102(8):2882–2888.
8. Victoza Patent Expiration. Drug Patent Watch. 2019.