Současná realita je však taková, že drtivá většina (a odborníci předpokládají, že je tomu ve více jak 99 % případů) analýz v rutinní klinické praxi je založena na imunochemických reakcích, jejichž užitečnost je po právu nepopiratelná. LCMS technika však může nabídnout vyšší specificitu a zvýšit tak věrohodnost kvantitativních výstupů ruku v ruce se značnou flexibilitou, co se analyzovaných typů látek týče (cílená analýza). A pokroku se bránit nikdo nechce.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Pragolab_Obr_1_LCMS_aparatury_Thermo_Scientific_na_bazi_trojitych_kvadrupolu_s_oznacenim_Medical_Devices_MD_pro_In_Vitro_Diagnostiku_IVD_dd07af0102/Pragolab-Obr.-1-LCMS-aparatury-Thermo-Scientific-na-bazi-trojitych-kvadrupolu-s-oznacenim-Medical-Devices-(MD)-pro-In-Vitro-Diagnostiku-(IVD).jpg" alt="Pragolab: Obr. 1: LCMS aparatury Thermo Scientific na bázi trojitých kvadrupólů s označením Medical Devices (MD) pro In Vitro Diagnostiku (IVD)"/>
Absolutně jiná situace se ustavila v klinickém výzkumu, jež je principiálně založen na hledání biomarkerů a tedy necílené analýze označované jako multi-omics platforma (metabolomika, proteomika, lipidomika, apod.), kde se bez hmotnostní spektrometrie LCMS neobejdeme, navíc s oblibou využíváme vysoké rozlišení orbitálních pastí doplněné o značnou stabilitu hmot, rychlé přepínání polarity a kombinaci akvizičních módů.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Pragolab_Orbitalni_pasti_v_klinicke_analyze_22_Skola_hmotnostni_spektrometrie_43d875b1fd/Pragolab-Orbitalni-pasti-v-klinicke-analyze-(22.-Skola-hmotnostni-spektrometrie).png" alt="Pragolab: Obr. 2: Schéma využití orbitálních pastí v klinickém výzkumu při hledání biomarkerů"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Pragolab_Obr_3_tri_zakladni_dulezite_oblasti_doplnujici_mereni_na_orbitalni_pasti_nutne_k_uspesne_necilene_analyze_v_klinicke_praxi_f5e6a31fbb/Pragolab-Obr.-3-tri-zakladni-dulezite-oblasti-doplnujici-mereni-na-orbitalni-pasti-nutne-k-uspesne-necilene-analyze-v-klinicke-praxi.png" alt="Pragolab: Obr. 3: Tři základní důležité oblasti doplňující měření na orbitální pasti nutné k úspěšné necílené analýze v klinické praxi"/>
Pro úspěšnou necílenou analýzu v klinické praxi je vhodné, ne-li nutné, doplnit workflow o vhodnou přípravu vzorků, předřadit separační techniku a zpracovat či vizualizovat výsledky vlastního měření. Zajímavý zástupce z oblasti přípravy vzorků <a href="https://lcms.cz/library?search=PaperSpray&amp;mainauthorItems=3">PaperSpray</a> našel komerční využití pod značkou VeriSpray. Kapka krve je nanesena na speciální papír zastřižený do špičky, na jehož konce je definovaně vloženo napětí tak, že analyty z krve se ionizují a sprejují směrem ke vstupu do hmotnostního spektrometru – jednoduché, praktické, rychlé.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Pragolab_Obr_4_komercne_dostupna_technika_paper_spray_pro_klinicke_vyuziti_analyzy_kapky_krve_0403439d15/Pragolab-Obr.-4-komercne-dostupna-technika-paper-spray-pro-klinicke-vyuziti-analyzy-kapky-krve.png" alt="Pragolab: Obr. 4: Komerčně dostupná technika paper spray pro klinické využití analýzy kapky krve"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Pragola_Obr_5_Iontova_mobilita_FAIMS_jakozto_ortogonalni_separacni_technika_k_chromatografickym_separacim_32662dea7b/Pragola-Obr.-5-Iontova-mobilita-FAIMS-jakozto-ortogonalni-separacni-technika-k-chromatografickym-separacim.png" alt="Pragolab: Obr. 5: Iontová mobilita FAIMS jakožto ortogonální separační technika k chromatografickým separacím"/>
Pro odhalení biomarkeru schovaného jako jehla v kupce sena mezi mnoha tisící jinými přítomnými látkami na rozličných úrovních se nabízí vedle chromatografické separace použít další, nejlépe ortogonální techniku separace, kterou může být iontová mobilita <a href="https://lcms.cz/library?search=FAIMS&amp;mainauthorItems=3">FAIMS</a> (field asymmetric-waveform ion-mobility spektrometry) umístěna za ambientního tlaku za iontovým zdrojem. Koeluované látky pak mají šanci být následně rozděleny, čímž se sníží pravděpodobnost „přehlédnutí“.
<blockquote>
<a href="https://lcms.cz/webinars?search=FAIMS">Záznamy webinářů s využitím techniky FAIMS</a> v multi-omics aplikacích
</blockquote>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Pragolab_Obr_6_schema_pokrocilych_automatizovanych_technik_akvizice_Acquire_X_a_Met_IQ_de4021ae31/Pragolab-Obr.-6-schema-pokrocilych-automatizovanych-technik-akvizice-AcquireX-a-Met-IQ.png" alt="Pragolab: Obr. 6: Schéma pokročilých automatizovaných technik akvizice AcquireX a Met-IQ.png"/>
Pro maximální stupeň charakterizace potenciálního biomarkeru se vedle přesně určeného elementárního složení vyvozeného z vysoce rozlišeného hmotnostního spektra doplňuje MS/MS či MS vyššího stupně fragmentace. Aby se zbytečně nefragmentovaly látky z pozadí či blanku, využívá se automatizovaná utilita <a href="https://lcms.cz/library?search=AcquireX&amp;mainauthorItems=3">AcquireX</a>, která tyto mateřské ionty vyloučí z následných operací. Nástroj Met-IQ pomáhá taktéž v reálném čase s automatizovaným rozhodováním, kdy se v drahoceném čase zabývat či nezabývat následnou fragmentací. Met-IQ kontinuálně srovnává MS/MS spektra přítomných analytů s metabolizovanou látkou a v případě podobnosti dá pokyn k vyššímu stupni fragmentace MS³.
<blockquote>
<a href="https://lcms.cz/webinars?search=AcquireX">Záznamy webinářů s využitím techniky AcquireX</a> v multi-omics aplikacích
</blockquote>
Všechny tyto nástroje mohou přispět k efektivním diagnostickým a terapeutickým přístupům v klinické praxi a zvýšit tak kvalitu našich životů.

Orbitální pasti v klinické analýze (22. Škola hmotnostní spektrometrie)

Biofarmaka zaujímají vedle kompletně synteticky připravených látek významnou a stále expandující oblast na poli léčiv. Může se jednat o krev a krevní komponenty, buňky, tkáně, vakcíny či celé živé organismy, ale hlavně monoklonální protilátky (mAb, struktura proteinu) a fúzní proteiny, které na trhu podle serveru <a href="https://www.pharmacompass.com/">Pharmacompass.com</a> dominují. Díky nim se poslední léta biofarmaka umísťují v žebříčcích nejprodávanějších (dle objemu peněz) léčiv na předních příčkách a v loňském roce se jich v prvních deseti umístilo úctyhodných šest (viz Obr. 1). Biologická léčba (tedy taková, kde jsou použita biofarmaka) našla nezastupitelnou roli ve zvyšování kvality života při onkologické a imunologické terapii nejen díky své efektivitě, ale hlavně díky minimalizaci vedlejších účinků.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/6f4bb95ce901497baa1521eda9e9240f/obrazek.png" alt="Obr. 1: nejprodávanější léčiva/účinné látky roku 2019 dle serveru pharmacompass.com"/>
Vakcíny nikdy nepatřily k hlavním tahounům farmaceutického průmyslu, což se však může brzy změnit díky současnému koronavirovému rozšíření (milovníci konspiračních teorií zvedají obočí). Nelze opomenout fakt, že významní potenciální producenti očkovacích agens proti SARS-CoV-2 viru nekonstruují vakcínu na bázi oslabených či mrtvých virů jak je běžně zvykem, ale na základě produkce (in vitro v bioreaktorech nebo in vivo v těle po vakcinaci) tzv. spike proteinů („satelitní struktury“ na povrchu viru, viz Obr. 2), které mají přítomnost koronaviru navodit a nastartovat kýženou imunitní reakci.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/408ab7e4589e41d6afc1dcad5a2e9b96/obrazek.png" alt="Obr. 2: skladba SARS-CoV-2 viru spolu s proteinovými strukturami (N Engl J Med 2020; 382:2261-2264)"/>
V kontextu s výše uvedenými skutečnostmi stojí analytičtí chemici před úkolem, jak zvládnout charakterizaci a následnou kvantifikaci účinných látek a potenciálních nečistot. Specialisté přicházející z prostředí ortodoxních molekulárně biologických technik nastavili a formálně v direktivách ukotvili praktická a v jistých mezích i dostatečná kritéria s pomocí technik jako je ELISA a SDS-PAGE. Jiní specialisté (léta bičovaní regulemi jakosti syntetických molekul), kteří využívají moderní chromatografické postupy s vysoko rozlišující hmotnostní spektrometrií (HRMS) bývají často zaskočeni, udiveni a navrhují nekompromisní zásahy založené na masivním využití platformy HRMS. Vždyť i k biologickým léčivům lze přistupovat v komplexním analytickém pojetí (i nejprodávanější účinnou bio-látku adalimumab lze popsat sumárním vzorcem C6428H9912N1694O1987S46).
První logický krok s HRMS přístupem se nabízí provést chromatografickou separaci na reverzní fázi s následnou hmotnostně spektrometrickou analýzou. Zde platí pravidlo o nastavení co největšího rozlišení na hmotnostním spektrometru (běžně 150 000, nejlépe &gt; 200 000 FWHM), čemuž vyhovují spektrometry s iontovou cyklotronou rezonancí nebo orbitální pastí. Díky cenové dostupnosti, bench-top uspořádání a nízkým provozním nákladům se orbitrapy (viz Obr. 3) stávají první volbou. Krásně vykreslená obálka různých nábojových stavů monoklonální protilátky ve stavu denaturovaném a nativním je znázorněna na Obr 4. Zajímavé zjištění přinese zoom jednoho nábojového klastru, resp. spektrum po dekonvoluci, kde lze elegantně pozorovat glykosylační adukty (lišící se počtem navázaných galaktózových jednotek, tj. s hmotnostním rozdílem 162), produkty posttranslační modifikace při bioprodukci. Detailní studium glykosylace může být provedeno iontově chromatografickou separací po kyselé hydrolýze (analýza monosacharidů)) nebo po glykosidázovém štěpení (analýza glykanů/oligosacharidů) nebo proteomickým bottom-up přístupem.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/60430b1fbf76409e87d8b47f885b0e69/obrazek.png" alt="Obr. 3: hmotnostní spektrum adalimumabu, ESI+, rozlišení 200 000 FWHM, orbitální past"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/d554adf14a7548fb839c2523ec5e064a/obrazek.png" alt="Obr. 4: princip detekce a zpracování signálu na orbitální iontové pasti"/>
Další krok při charakterizaci biofarmak by měl směřovat k ortogonální separaci (proti reverzní fázi) na iontoměniči. Protože monoklonální protilátky a fúzní proteiny mají díky přítomnosti amino- a karboxylových skupin dostatečný náboj v širokém rozmezí pH, očekává se zajímavý profil, neboť na základě poznatků z glykosylačních studií podléhají biofarmaka rozsáhlým posttranslačním modifikacím. 
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/9dd536d0d0ba46a7a3111048279dc1e0/obrazek.png" alt="Obr. 5: glykosylační adukty adalimumabu (lišící se počtem navázaných galaktózových jednotek, tj. s hmotnostním rozdílem 162), produkty posttransalční modifikace při bioprodukci"/>
Výsledek je bez zardění překvapující. Díky vazbě až dvou molekul lysinu na C-konce protilátky a procesu vícenásobné deamidace aminokyselin asparaginu a glutaminu v řetězci proteinu dochází k tvorbě (a nikoliv na úrovni stopových množství) k řadě různě nabitých variant oddělitelných jak chromatograficky tak i hmotnostně spektrometricky, viz Obr. 6, 7 a 8.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/48342dcb5f02418fa1347be3035adfb6/obrazek.png" alt="Obr. 6: chromatografická separace finální monoklonální protilátky na iontoměniči odhalující přítomnost nábojových variant "/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/d3fe94df7d894c0487a298fc3666651b/obrazek.png" alt="Obr. 7: chromatografická separace adalimumabu na iontoměniči odhalující přítomnost nábojových variant (deamidace + lysinové modifikanty); HRMS spektrum dokladuje charakterizaci trojnásobného deamidačního produktu, navíc glykosylovaného, na nízké koncentrační úrovni"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/e57c74c67e0c4dcbbee527ba309532f6/obrazek.png" alt="Obr. 8: profily jednotlivých finálních forem komerčně dostupných biofarmak z pohledu přítomnosti nábojových variant z procesu posttranslační modifikace"/>
Studium dalších a dalších modifikací biofarmak se zdá být bezbřehé. S orbitálními pastmi lze odhalovat oxidace na methioninu a tryptofanu, tvorbu pyroglutamátů nebo např. rozpad disulfidické vazby; významná kapitola odhalování nečistot při bioprocesu je také detekce a následná eliminace proteinů z hostitelské buňky (host cell proteins). Podpora a implementace moderních chromatografických a hmotnostně spektrometrických postupů se stává klíčem k úspěšnému analytickému zvládnutí problematiky charakterizace a kvantifikace biofarmak a příbuzných nečistot.

21. Škola hmotnostní spektrometrie: Orbitální pasti ve vývoji biofarmak

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Škola hmotnostní spektrometrie je odborná vzdělávací akce pořádaná od roku 1986, která vedle zajímavých přednášek a kurzů nabízí i nespočet příležitostí k přátelským setkáním a diskusím.

Orbitální pasti v klinické analýze (22. Škola hmotnostní spektrometrie)

21. Škola hmotnostní spektrometrie: Orbitální pasti ve vývoji biofarmak

Nejbližší akce

Waters at ISC 2026

DataApex at ISC 2026

Shimadzu at ISC 2026

Webináře

Learn to Select and Apply the Proper Internal Standard in ICP-OES

ADC characterization in one native LC-MS workflow

Spatial Proteomics for Translational Research