Mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) patří mezi moderní a jednoduché postupy přípravy vzorků. Tato práce se zabývá využitím těchto technik pro stanovení mastných kyselin v pivu. Zatímco z SPME vlákna byly analyty uvolněny termální desorpcí ve vyhřátém injektoru plynového chromatografu vybaveného křemennou kapilární kolonou ZB-WAX a plamenoionizačním detektorem, tak z míchací tyčinky byly vyextrahované látky uvolněny po zpětné extrakci do malého množství rozpouštědla a pak stanoveny na plynovém chromatografu. Kromě pracovních charakteristik obou postupů jsou uvedeny výhody a omezení těchto metod.
<h3>1 ÚVOD</h3>
Mastné kyseliny jsou jednou ze skupin látek, které mohou ovlivnit senzorické vlastnosti piva. Kromě toho mohou mít vliv na vitalitu kvasinek a také na stabilitu pivní pěny (1-3).
Nasycené mastné kyseliny (hexanová – dekanová kyselina) vznikají během kvašení (4). Tyto kyseliny se vyznačují žluklým nebo kozím aroma. Senzorické příspěvky těchto kyselin jsou kumulativní. Proto se tedy tyto cizí příchutě mohou projevit i tehdy, když koncentrace žádné z těchto kyselin nepřesahuje prahovou hodnotu vnímání (5). Obsah vyšších mastných kyselin jako je kyselina linolová a linolenová je významný z toho hlediska, že jejich oxidativní degradací může dojít ke vzniku typické staré chuti (6).
Z těchto důvodů je nutné mít k dispozici vhodnou analytickou metodu umožňující rychlé stanovení mastných kyselin v pivu. Mastné kyseliny se obvykle stanovují metodou plynové chromatografie. Při přípravě vzorků je možné namísto dříve používaných postupů založených na destilaci s vodní párou (7,8) nebo modernějších postupů využívajících extrakci na pevné fázi (9,10) s výhodou použít moderní metody jako je mikroextrakce na pevné fázi nebo sorpční extrakce na míchací tyčince.
Princip a využití mikroextrakce na pevné fázi (SPME) v pivovarské analytice bylo popsáno v úvodním článku této série (11). Teorie a možnosti praktického uplatnění sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) jsou popsány v následující práci (12).
V této práci jsou na konkrétním příkladě stanovení volných mastných kyselin v pivu ukázány možnosti dvou mikroextrakčních technik – SPME v headspace uspořádání a SBSE s následnou zpětnou extrakcí do organického rozpouštědla. Jsou diskutovány výhody a nevýhody obou postupů a také porovnány pracovní charakteristiky výše zmíněných metod.
<h3>2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST</h3>
<h5>2.1 Použité chemikálie, standardy</h5>
Ethanol, síran amonný – Lach – Ner, s. r. o., ČR; helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0 a syntetický vzduch – Messer, ČR; ultračistá voda – Milli-RO 5plus firmy Millipore, USA. 
Kyselina hexanová (kapronová), heptanová, oktanová (kaprylová), nonanová (pelargonová), dekanová (kaprinová), undekanová, dodekanová (laurová), tridekanová, tetradekanová (myristová), pentadekanová, hexadekanová (palmitová), heptadekanová, oktadekanová (stearová), cis-9-oktadekanová (olejová), cis-9,cis-12-oktadekadienová (linolová) a cis,cis,cis-6,9,12-oktadekatrienová (linoleová) a derivatizační činidlo BF3 v 10% methanolu byly nakoupeny od Sigma-Aldrich, USA.
Vzorky piva plzeňského typu, vyrobené a balené v České republice, byly zakoupeny v běžné maloobchodní síti.
<h5>2.2 Podmínky plynové chromatografie</h5>
Vlastní stanovení probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001 vybaveném split/splitless injektorem a plamenoionizačním detektorem. K separaci byla použita 30 m dlouhá křemenná kapilární kolona ZB-Wax firmy Phenomenex s vnitřním průměrem 0,32 mm a tloušťkou filmu 0,25 μm. Kolona byla temperována na 120 °C po dobu 2 min, poté následoval teplotní gradient 10 °C/min do teploty 150 °C a následně 30 °C/min až do teploty 200 °C. Při této teplotě kolona zůstala po dobu 15 min. Nástřik byl prováděn ve splitless módu, split ventil byl otevřen po 0,5 min. Injektor i plamenoionizační detektor byly vyhřáty na teplotu 250 °C. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na kolonu byl 150 kPa při 75 °C.
<h5>2.3 Headspace SPME</h5>
K extrakci bylo použito SPME vlákno s fází typu Carbowax-Divinylbenzen o tloušťce vrstvy 65 μm. Vlákno bylo umístěno v manuálním držáku pro SPME vlákna a vše bylo zakoupeno od Supelco, USA.
Vzorky piva byly před analýzou vychlazeny na 4 °C. Všechny pokusy vedoucí k porovnání pracovních charakteristik byly prováděny na modelovém roztoku 5 % obj. ethanolu ve vodě. Před použitím bylo vlákno kondicionováno v injektoru plynového chromatografu při teplotě 250 °C po dobu 30 min. Extrakce byla založena na podmínkách popsaných Horákem a kol. (13).
Extrakce byla prováděna v headspace prostoru nad 4 ml vzorku obohaceného přídavkem kyseliny heptanové a undekanové, které byly využity jako vnitřní standardy (výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l), ve skleněné vialce o objemu 20 ml uzavřené septem krytým hliníkovou fólií. K podpoře extrakce bylo využito vysolení pomocí 1,0 g síranu amonného. Před zahájením SPME extrakce byla vialka se vzorkem intenzivně třepána po dobu 10 s. Extrakce probíhala za laboratorní teploty po dobu 30 min.
Po extrakci bylo vlákno termálně desorbováno při teplotě 250 °C v nástřikovém prostoru plynového chromatografu po dobu 5 min. Injektor plynového chromatografu byl osazen linerem o vnitřním průměru 0,75 mm. Podmínky chromatografické separace jsou popsány v kap. 2.2.
<h5>2.3 Analýzy metodou SBSE</h5>
K extrakci byla použita míchací tyčinka o délce 10 mm a vnějším průměru 3,2 mm pokrytá polydimethylsiloxanovou (PDMS) vrstvou o tloušťce 0,5 mm. Tato míchací tyčinka pod komerčním názvem Twister byla zakoupena od Gerstel, Německo.
Twister byl před použitím kondicionován ve skleněné trubičce při teplotě 300 °C po dobu 60 min v atmosféře helia o průtoku 50 ml/min. Mastné kyseliny byly vyextrahovány vložením Twisteru do 10 ml vzorku obohaceného vnitřními standardy (kyseliny heptanová, undekanová, tridekanová a pentadekanová – výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l) v 20 ml skleněné vialce. Vialka byla uzavřena víčkem s PTFE/silikonovým septem. Extrakce probíhala za podmínek popsaných Horákem a kol. (14). Twisterem bylo mícháno rychlostí 1000 ot/min po dobu 60 min za laboratorní teploty. Po skončení extrakce byl Twister pomocí pinzety vyndán ze vzorku, krátce opláchnut destilovanou vodou a osušen buničitou vatou. Pro zpětnou extrakci do rozpouštědla byl poté Twister vložen do insertu o objemu 350 μl obsahujícím 200 μl rozpouštědla dichlormethan:hexan v poměru 50:50. Insert byl vložen do vialky o objemu 2 ml a uzavřen PTFE/silikonovým septem a vložen na míchadlo při 1000 ot/min po dobu 40 min.
Ke stanovení nižších mastných kyselin (C6 – C12) byly 2 μl výše získaného extraktu nastříknuty na kolonu plynového chromatografu a separace proběhla za podmínek popsaných v kap. 2.2.
Ke stanovení vyšších mastných kyselin bylo nutné získaný SBSE extrakt odpařit pod jemným proudem dusíku a derivatizovat methylací pomocí 0,1 ml BF3 v 10% methanolu po dobu 20 min při teplotě 95 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 0,1 ml vody. Methylestery vyšších mastných kyselin byly extrahovány do 0,1 ml hexanu v ultrazvukové lázni po dobu 2 min (15). Podmínky chromatografické separace byly stejné jako při stanovení nižších mastných kyselin.
<h3>3 VÝSLEDKY A DISKUSE</h3>
Pro všechny stanovované volné mastné kyseliny byla proměřena kalibrační křivka v rozsahu koncentrací běžných pro pivo plzeňského typu (0,0015 mg/l až 8 mg/l) v 5 % obj. roztoku ethanolu. Jak vyplývá z tab. 1, lepší shody bylo dosaženo proložením jednotlivých kalibračních bodů kvadratickou křivkou namísto lineární regrese. Korelační koeficienty nižších mastných kyselin při použití lineární regrese ležely pro metodu SPME v rozmezí 0,9951 až 0,9983, pro SBSE extrakci v rozmezí 0,9919 až 0,9995. Při aplikaci kvadratické křivky rozsah hodnot korelačních koeficientů byl od 0,9956 do 0,9993 pro SPME postup, respektive od 0,9931 do 0,9993 pro SBSE metodu.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/fc23ecae21e94964b039470f21d22f4d/obrazek.png" alt="Tab. 1 Korelační koeficienty pro stanovení volných mastných kyselin v pivu pomocí metody SPME a SBSE"/>
Vzhledem k tomu, že při použití metody SPME dochází v injektoru plynového chromatografu k termální desorpci všech analytů vyextrahovaných na SPME vlákno, nelze tímto postupem v rámci jednoho extrakčního kroku stanovit jak nižší, tak vyšší mastné kyseliny. Ke stanovení vyšších mastných kyselin by bylo nutné SPME extrakci opakovat. Následná derivatizace vyšších mastných kyselin přímo na vlákně je sice možná, ale použití, respektive manipulace s diazomethanovým činidlem není úplně bezproblémové (16). Z tohoto důvodu byly vyšší mastné kyseliny stanoveny jen SBSE postupem. Korelační koeficienty pro tyto kyseliny leží v intervalu 0,9981–0,9998 v případě lineární regrese a v rozmezí 0,9994–0,9997 při použití kvadratické křivky.
Z výsledků je patrné, že obě metody se v daném koncentračním rozmezí vyznačují vysokou linearitou. 
Správnost metod byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah volných mastných kyselin v pěti reálných vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem mastných kyselin na koncentrační hladině 2 mg/l každé látky. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2. Výtěžnost SPME metody se nacházela v rozmezí 95–110 %. U metody SBSE byla výtěžnost nižších mastných kyselin podstatně horší (57–89 %). Příčina této malé výtěžnosti spočívá pravděpodobně v tom, že jako extrakční fáze je použita nepolární polydimethylsiloxanová vrstva Twisteru, do níž se tyto polární (zejména kyselina kapronová) nižší mastné kyseliny extrahují obtížně. Extrakci látky z kapalné fáze do extrakční fáze je možné, i když ne úplně přesně, popsat pomocí rozdělovacího koeficientu oktanol-voda (Ko/w) (17,18). Hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanol-voda pro stanovované látky jsou uvedeny v tab. 3. Podle práce Baltussen a kol. (19) budou Twisterem kvantitativně vyextrahovány látky s Ko/w větším než 500 (odpovídá log Ko/w &gt; 2,70). Hodnota log Ko/w pro kyselinu kapronovou je pouze 1,88, což naznačuje, že tato látka se bude obtížně extrahovat. Experimentálně dosažená výtěžnost 57 % pro tuto kyselinu tento teoretický předpoklad potvrzuje. Výtěžnosti vyšších mastných kyselin, jejichž log Ko/w &gt; 6,10, dosahovaly podle očekávání vysokých hodnot 94–110 %.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/c24cf22a2233455e9d30758937512b3b/obrazek.png" alt="Tab. 2 Výtěžnost a opakovatelnost SPME a SBSE postupů při stanovení volných mastných kyselin v pivu (CV – variační koeficient)"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/093790ed7966404492d3d06c50f61525/obrazek.png" alt="Tab. 3 Hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanol-voda pro nižší a vyšší mastné kyseliny"/>
Opakovatelnost metod byla zjištěna pětinásobným opakováním celého postupu během jednoho dne na jednom a témž vzorku piva. Z výsledků uvedených v tab. 2 je vidět, že pro kyseliny kapronovou a kaprylovou byla hodnota relativní směrodatné odchylky (RSD) zhruba dvakrát horší při použití metody SBSE než u SPME postupu. To je zřejmě způsobeno jejich horší výtěžností. Naproti tomu u dalších homologických kyselin (kaprinová a laurová) jsou hodnoty RSD u obou postupů srovnatelné. Výrazně vyšší hodnoty opakovatelnosti (14,8–16,3 %) pro vyšší mastné kyseliny (myristovou – linolenovou) lze vysvětlit tím, že k jejich stanovení jsou ještě zapotřebí další dva kroky – derivatizace a následná extrakce methylesterů do hexanu. Každý z těchto kroků přispívá svým dílem k výsledné hodnotě RSD. Nicméně i tyto hodnoty RSD jsou plně akceptovatelné.
<h3>4 ZÁVĚR</h3>
Z výše uvedených výsledků je vidět, že pro stanovení mastných kyselin v pivu lze použít oba moderní postupy přípravy vzorků – SPME a SBSE. Obě techniky se vyznačují jednoduchostí, výbornou opakovatelností a žádnou nebo minimální spotřebou rozpouštědel.
Pro stanovení nižších mastných kyselin je vhodnější metoda SPME s vláknem potaženým fází typu Carbowax-Divinylbenzen. Pro tyto látky dosahuje toto SPME vlákno lepší výtěžnosti a opakovatelnosti než nepolární fáze Twisteru. Další nezanedbatelnou výhodou SPME postupu je jeho výrazně nižší časová náročnost (35 min oproti 160 min při použití SBSE metody). Na druhé straně značná nevýhoda spočívá v nemožnosti současného stanovení vyšších mastných kyselin v rámci jednoho extrakčního kroku.
Výhoda sorpční extrakce na míchací tyčince se zakládá na tom, že míchací tyčinka je podstatně robustnější než křehké SPME vlákno. Zacházení s SBSE je rovněž jednoduché, ale proces extrakce a následné reextrakce zabere podstatně více času.
Ačkoli obě techniky představují zaměnitelné alternativy, v případě požadavku na stanovení pouze nižších mastných kyselin v pivu je metoda SPME výhodnější. Pokud je nutno stanovit obsah jak nižších, tak vyšších mastných kyselin, bez problémů je možno využít techniku SBSE.

Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva. Část 3. - Mikroextrakce na pevné fázi a extrakce na míchací tyčince při analýze mastných kyselin v pivu

K moderním a stále více se prosazujícím metodám přípravy vzorků při analýze senzoricky aktivních látek v pivu patří extrakce na pevné fázi (SPE) a mikroextrakce na pevné fázi (SPME).
Vzhledem k stále se rozšiřující nabídce různých sorbentů pro SPE a fází pro SPME bylo na příkladu stanovení mastných kyselin v pivu provedeno porovnání 11 SPE kolonek jednak z hlediska různých výrobců téhož typu sorbentů a jednak různých typů sorbentů, a dále pak porovnání 3 typů SPME vláken. V práci jsou porovnány pracovní charakteristiky SPE a SPME metody. Vlastní stanovení mastných kyselin probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001 vybaveném křemennou kapilární kolonou SPB-1000 (Supelco, délka 30 m, průměr 0,32 mm a tloušťka filmu 0,25 μm) a plamenoionizačním detektorem.
<h3>1 ÚVOD</h3>
K nejpoužívanějším metodám pro přípravu vzorků piva k analýze senzoricky aktivních látek patří destilace s vodní párou, extrakce v systému kapalina-kapalina a headspace technika. Tyto postupy se často vyznačují časovou náročností a používáním organických rozpouštědel, která navíc mohou být zdraví škodlivá. V současné době stále stoupají požadavky na rychlost a zároveň spolehlivost analytických metod společně s ekonomickými aspekty. K typickým příkladům metod pro přípravu vzorků vyhovujícím dnešním nárokům patří extrakce na pevné fázi (SPE) a mikroextrakce na pevné fázi (SPME).
SPE je extrakční metoda pracující s pevnou a kapalnou fází. S úspěchem nahrazuje klasickou extrakci v systému kapalina-kapalina. Kapalná fáze obsahuje stanovované látky včetně dalších látek obsažených v matrici. Princip spočívá v zachycení sledovaných analytů, které jsou obsaženy v kapalné fázi, na speciálním sorbentu díky silným, ale vratným interakcím mezi analytem a povrchem stacionární fáze, přičemž by nemělo dojít k interakcím mezi stacionární fází a složkami matrice. Mezi typické interakce patří hydrofobní van der Waalsovy síly, polární vodíkové můstky, síly dipól-dipól nebo iontově výměnné interakce. Sorbent je umístěn mezi fritami v extrakční minikolonce určené na jedno použití. Cílem tohoto postupu je jednak odstranění interferujících látek obsažených v matrici a jednak izolace a zkoncentrování (100x-5000x) stanovovaných látek.
Díky jednoduchosti a snadnému použití SPE vyústil zájem o tuto techniku ke komerčnímu používání jednorázových minikolonek. Tyto kolonky jsou plněny různými sorbenty o různé velikosti částic. K přetlačení vzorku a promývacího roztoku skrze kolonku je díky velikosti částic možné použít nízkého tlaku. Jako sorbenty se nejčastěji používají modifikovaný i nemodifikovaný oxid křemičitý, oxid hlinitý, polymery atd. Pro obrácenou fázi jsou k dispozici oktadecyl (C₁₈), oktyl (C₈), etyl (C₂), cyklohexyl, fenyl, butyl (C4). Pro normální fázi se používá oxid křemičitý modifikovaný skupinami kyano (-CN), amino (-NH₂), dioly (-COHCOH). Pro adsorpci se využívá silikagel (-SiOH), florisil (Mg₂SiO₂), oxid hlinitý (Al₂O₃). K iontové výměně se využívá skupin amino (-NH₂), kvarterního aminu (N⁺), karboxylové skupiny (-COOH), aromatické sulfonové kyseliny (ArSO₂OH) nebo polyetyleniminu (-(CH₂CH₂NH)n-).
Velmi důležitým kritériem umožňujícím vysokou opakovatelnost analytických výsledků je zajištění konstantní kvality různých šarží jednorázových SPE kolonek. K tomuto účelu se jako charakteristika SPE kolonky používá kapacita kolonky. Kapacita se vyjadřuje jako poměr mg analytu/g sorbentu a znamená, že za stejných podmínek různé šarže kolonek adsorbují a desorbují stejné množství analytu. Stejnoměrnou kvalitu šarží dnes většinou firmy garantují certifikovaným procesem výroby SPE kolonek.
Metoda SPE zahrnuje čtyři po sobě jdoucí kroky.
<ol>
<li>Kondicionace sorbentu. V tomto kroku se SPE kolonka připraví na interakci se vzorkem. Často se provádí methanolem, vodou nebo pufrem. Jde o nezbytný krok pro reprodukovatelnou sorpci analytů.
</li>
<li>Aplikace vzorku. Vzorek se pomocí vakua prosaje skrz kolonku. Sledované analyty se zachytávají v úzké zóně na sorbentu. Část interferujících látek z matrice projde kolonkou přímo do odpadu, část se adsorbuje.
</li>
<li>Promytí. Zachycené interferující látky matrice jsou odstraněny z povrchu stacionární fáze. 
</li>
<li>Eluce. V tomto kroku dochází k selektivní desorpci analyzovaných látek pomocí vhodného rozpouštědla (1, 2).
</li>
</ol>
Při vývoji SPE metody je nutné zvážit následující hlediska:
<ol>
<li>Stanovení cíle metody pro přípravu vzorků. Jak vysoké výtěžnosti musíme dosáhnout? Jak vysokého stupně odstranění interferujících látek musíme pro koncovou analýzu dosáhnout? Bude dosažené zkoncentrování dostatečné pro konečnou analýzu? Jaké rozpouštědlo je optimální pro sledované analyty? Jaké prostředky jsou dostupné pro vývoj metody a pro rutinní analýzu?
</li>
<li>Zvážit vlastnosti vzorku – jak matrice, tak sledovaných analytů. Jaká je matrice vzorku, je silně polární nebo nepolární? Jak velký je objem vzorku? Jaké funkční skupiny mohou mít vliv na rozpustnost analyzovaných látek – polarita, disociační konstanta, atd.?
</li>
<li>Na základě výše uvedených bodů je nutné zvolit retenční mechanismus, typ fáze, množství sorbentu a vhodnou velikost SPE kolonky, která by nejlépe vyhovovala vlastnostem vzorku a cílům kladeným na přípravu vzorku. Obecně platí, že hmotnost analytu, který má být sorbován, by měla být maximálně 5 % hmotnosti sorbentu. Co se týče velikostí SPE kolonek do objemu 1 ml vzorku se používá 1 ml kolonka. 3 ml kolonka je vhodná od 1 ml do 250 ml vzorku, 6 ml kolonka od 1 ml do 250 ml pro rychlou předseparaci, 12, 20 a 60 ml kolonky se využívají pro objemy vzorků od 10 ml do 1 litru.
</li>
<li>Prostřednictvím experimentů s roztoky standardů optimalizovat dávkování a vymývání, určit chování analytu na sorbentu v závislosti na změně extrakčních podmínek. Na základě těchto experimentů zoptimalizovat podmínky pomocí pokusů s reálnou matricí, s použitím obohacených vzorků zjistit výtěžnost, opakovatelnost, čistotu získaného extraktu. Nakonec je třeba celou metodu zvalidovat (3).
</li>
</ol>
Při analýze piva a dalších nápojů se SPE metoda používá např. pro stanovení vyšších aromatických alkoholů (tyrosol, tryptofol, guajakol) (4), mastných kyselin (5, 6), furfuralu, hydroxymethylfurfuralu (7), iso-α-hořkých kyselin (8), ATNC (zdánlivých celkových N-nitrososloučenin) (9), biogenních aminů (10), sacharinu (11).
Mikroextrakce na pevné fázi – SPME – je adsorpčně/desorpční technika vyvinutá Pawliszynem na University of Waterloo v 1. pol. 90. let a patentovaná firmou Supelco. Je vhodná především pro stanovení těkavých látek jako alternativa ke klasické headspace technice. Princip použití a způsob vzorkování byl už v Kvasném průmyslu popsán (12).
Technika SPME se v pivovarské analytice využívá např. pro stanovení nižších alkoholů a esterů (13, 14), vicinálních diketonů (15), dimethylsulfidu (16) nebo mastných kyselin (17).
Předložená práce se na příkladu stanovení mastných kyselin zabývá porovnáním jedenácti SPE kolonek a dále pak porovnáním tří typů SPME vláken.
<h3>2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST</h3>
<h5>2.1 Použité materiály, standardy</h5>
V práci byly použity SPE kolonky fy Merck: LiChrolut EN 200 mg/3 ml (ethylvinylbenzen divinylbenzen polymer s extrémně velkým specifickým povrchem), LiChrolut RP-18 200 mg/3 ml, LiChrolut RP-18 500 mg/3 ml; Varian: Abselut Nexus LRC 60 mg (polymerní sorbent nevyžaduje kondicionaci, a tak se celý SPE proces redukuje ze čtyř kroků na tři (pro nepolární látky); Agilent Technologies: Zorbax C18-EC 500mg (oxid křemičitý velmi vysoké čistoty); Phenomenex: Strata C18-E 200 mg/3 ml, Strata X 200 mg/6 ml (polymer), Strata SDB-L 200mg/3 ml (styren divinylbenzen); Supelco: Discovery DSC-18 500 mg/3 ml (polymerně vázaný oktadecyl), Discovery DSC-18LT 500 mg/3 ml (monomerně vázaný oktadecyl – 11 % C), Supelclean ENVI-CARB 250 mg/3 ml (grafitizovaný neporézní uhlík).
Pro SPME metodu byla odzkoušena vlákna: Carbowax/DVB – 65μm, PDMS – 100 μm a Carboxen/PDMS, 75 μm (vše Supelco). Kyselina butanová (máselná), pentanová (valerová), hexanová (kapronová), heptanová, oktanová (kaprylová), nonanová (pelargonová), dekanová (kaprinová), undekanová, dodekanová (laurová), tridekanová, tetradekanová (myristová), pentadekanová, hexadekanová (palmitová), heptadekanová, oktadekanová (stearová), oktadekadienová (linolová), oktadekatrienová (linolenová), oktadecenová (olejová) – Supelco. Methylestery kyselin oktanové, dekanové, dodekanové, tridekanové, tetradekanové, pentadekanové, hexadekanové, heptadekanové, oktadekanové, oktadekadienové, oktadekatrienové, oktadecenové – Supelco.
Derivatizační činidlo BF₃ – methanol 14% – Fluka.
<h3>2.2 Metoda</h3>
Nižší mastné kyseliny C₄–C₁₂ byly po extrakci metodou SPE stanoveny jako volné kyseliny, zatímco vyšší mastné kyseliny C₁₄–C₁₈ byly analyzovány ve formě methylesterů po derivatizaci pomocí BF₃ ve 14% methanolu. Postup extrakce vycházel z práce (6). 
Způsob extrakce nižších mastných kyselin C₄–C₁₂ metodou SPME byl založen na metodě popsané v práci (17). 
Vlastní analytické stanovení probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001, který byl vybaven automatickým dávkovačem Labio ASG 40. Chromatografická separace probíhala na 30 m dlouhé křemenné kapilární koloně SPB-1000 firmy Supelco s vnitřním průměrem 0,32 mm a tloušťkou filmu 0,25 μm. Kolona byla temperována na 120 °C po dobu 2 min, poté následoval teplotní gradient 10 °C/min do teploty 150 °C a následně 30 °C/min až do teploty 200 °C. Při této teplotě kolona zůstala po dobu 15 min. Injektor i plamenoionizační detektor (FID) byly vyhřáty na teplotu 250 °C. Při analýze vzorků extrahovaných metodou SPE byl nástřik prováděn v režimu split 1:10. Při stanovování analytů extrahovaných metodou SPME byl nástřik prováděn ve splitless módu, split ventil byl otevřen po uplynutí 0,5 min. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na koloně byl 100 kPa při 75 °C.
Methylestery vyšších mastných kyselin byly analyzovány za stejných chromatografických podmínek.
<h3>3 VÝSLEDKY A DISKUSE</h3>
Porovnání účinnosti jednotlivých SPE kolonek při extrakci mastných kyselin o přibližné koncentraci každé kyseliny 2,0 mg/l v modelovém roztoku 5% ethanolu včetně cenového srovnání uvádí tab. 1. 
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/80c73c637dcb4bde80fec9de46caedc4/obrazek.png" alt="Tab. 1 Porovnání extrakční účinnosti SPE kolonek včetně cenového srovnání"/>
Porovnání SPME vláken ukazuje tab. 2.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/368b99cc8a8c4535840abcb15417cfb4/obrazek.png" alt="Tab. 2 Porovnání extrakční účinnost SPME vláken"/>
Z výsledků je vidět, že stejné typy sorbentů (LiChrolut RP-18, Strata C18-E, Discovery DSC-18) poskytují pro nižší mastné kyseliny srovnatelné výsledky. Lepších výsledků bylo dosaženo na kolonce Zorbax C18-EC, bohužel dle sdělení dodavatele se tento sorbent obsahující vysoce čistý oxid křemičitý již nedodává. 
Polymerní sorbenty (LiChrolut EN, Abselut NEXUS LRC, Strata X, Strata SDB-L) i grafitizovaný uhlík dosahují pro nižší mastné kyseliny výrazně vyšší extrakční účinnosti.Naopak extrakce vyšších mastných kyselin je podstatně nižší než u klasických C-18 sorbentů. Nevýhodou je také vyšší cena. Jak vyplývá z tab. 2, nejlepších výsledků při extrakci nižších mastných kyselin z modelového roztoku bylo dosaženo použitím SPME vlákna pokrytého fází 65 μm Carbowax-Divinylbenzen. 
Vzhledem k tomu, že při stanovení mastných kyselin v pivu se nejedná o stopové koncentrace, není nutné použít materiál dosahující nejlepších extrakčních schopností. Pracovní charakteristiky SPE metody tedy byly zjištěny pro ekonomicky nejvýhodnější sorbent Strata C18-E 200 mg/3 ml. Pro SPME metodu bylo využito vlákno Carbowax-Divinylbenzen.
Správnost metody byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah volných mastných kyselin v deseti reálných vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem mastných kyselin na koncentrační hladině 2 mg/l každé látky. Opakovatelnost metody byla zjištěna opakovanou analýzou jednoho a téhož vzorku piva (10krát během jednoho dne).
Výsledky uvedené v tab. 3 ukazují, že pro stanovení kyselin kapronové až laurové jsou metody SPE a SPME srovnatelné. Při menším počtu vzorků je z časového hlediska a větší jednoduchosti výhodnější metoda SPME. Na druhé straně při měření větší série vzorků je při využití automatického dávkování vzorků do plynového chromatografu výhodnější metoda SPE. Touto metodou je navíc možné proměřit větší spektrum mastných kyselin. Derivatizace extraktu získaného SPE technikou pomocí BF₃ v 14% methanolu je jednoduchá a bezpečná na rozdíl od derivatizace diazomethanem na SPME vlákně. Výrazně nižší výtěžnost kyselin máselné a valerové je zřejmě důsledkem jejich vyšší těkavosti způsobena ztrátami při vysušování kolonky.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/a5088e5bbc7644a3bb0e3373c53105c7/obrazek.png" alt="Tab. 3 Výtěžnost a opakovatelnost SPE a SPME metody pro stanovení mastných kyselin v pivu (CV – variační koeficient)"/>
<h3>4 ZÁVĚR</h3>
SPE a SPME metody přípravy vzorků představují velmi silný nástroj zefektivnění provádění analytických rozborů. Na trhu je dostupná široká nabídka různých sorbentů od různých výrobců, se kterými lze, jak bylo demonstrováno na příkladu stanovení mastných kyselin v pivu, dosáhnout velmi dobrých výsledků. Vždy je nutné zvážit požadavky, které budeme na metodu klást. Z uvedeného příkladu je patrné, že i ekonomicky nejvýhodnější sorbent může v konkrétním daném případě poskytnout naprosto vyhovující parametry.

Využití SPE a SPME při analýze piva

Ke stanovení senzoricky aktivních látek v pivu se používají analytické metody, které vyžadují úpravu vzorku. K tomu se využívají techniky založené na extrakci v systému kapalina-kapalina, extrakci na pevné fázi (SPE) nebo destilační postupy. V poslední době se stávají populárními mikroextrakční metody, jako např. mikroextrakce na pevné fázi (SPME) nebo extrakce na míchací tyčince (SBSE).
Tato práce se zabývá využitím extrakce na míchací tyčince při stanovení některých senzoricky aktivních látek v pivu. Použita byla míchací tyčinka (10 mm dlouhá, o průměru 1,3 mm) pokrytá polydimethylsiloxanem od firmy Gerstel GmbH, komerčně nazývaná Twister. Twister byl vložen přímo do vzorku piva a míchán. Poté byl Twister vyjmut, opláchnut destilovanou vodou a eluován 200 μl organického rozpouštědla. Nakonec byl získaný extrakt analyzován metodou plynové chromatografie. Práce obsahuje pracovní charakteristiky optimalizované metody.
<h3>1 ÚVOD</h3>
Je známo, že pivo obsahuje velké množství senzoricky aktivních látek. Jde o těkavé i netěkavé látky (bylo jich identifikováno přes 800), jejichž koncentrace ale nic neříká o významu této sloučeniny ve vztahu k senzorickým vlastnostem finálního výrobku. Teprve porovnání její koncentrace s koncentrací prahovou může dát požadovanou informaci (1). Překročení prahové hodnoty jedné nebo více látek běžně se vyskytujících pod prahovou hodnotou se může projevit jako senzorická závada. Ale i příliš nízká koncentrace některé ze základních chuťových složek nebo i úplná absence této látky může negativně ovlivňovat výslednou chuť a vůni piva (2). Je pochopitelné, že celkový senzorický profil piva se kromě ceny a obalu rozhodujícím způsobem podílí na úspěchu piva na trhu. Důležitá je také stálost tohoto profilu, kdy zákazník nesmí být zklamán koupí téhož výrobku po určité době. 
Z těchto důvodů se věnuje pozornost analytickému stanovení obsahu některých významných skupin senzoricky aktivních látek. Jednou z nich jsou estery, jejichž převážná část se tvoří při hlavním kvašení a většinou se vyznačují příjemnou vůní připomínající některé druhy ovoce. Podle Arkima a Jounela-Erikssona se estery podílejí na celkovém arómatu piva asi jednou pětinou (3).
K analytickému stanovení senzoricky aktivních látek se používají hlavně metody plynové chromatografie. K přípravě vzorku se využívají klasické postupy jako headspace technika, prekoncentrační metody purge-and-trap, destilační postupy, extrakce v systému kapalinakapalina nebo extrakce na pevné fázi (4–9). Vhodnou alternativou ke klasické headspace technice výrazným způsobem snižující pořizovací náklady je mikroextrakce na pevné fázi (SPME). Koncept této techniky byl navržen v prvé polovině devadesátých let Januszem Pawliszynem na University of Waterloo (Ontario, Kanada). Jde o sorpčně-desorpční techniku. Její princip spočívá v nanesení malého množství sorbentu na vlákno z křemenného skla. Vlákno se ponoří do vzorku nebo do plynné fáze nad vzorkem. Po ustanovení rovnováhy se vlákno vytáhne ze vzorkované matrice a vloží se do nástřikového prostoru plynového chromatografu. Látky zachycené na sorbentu tepelně desorbují a jsou unášeny nosným plynem na kolonu chromatografu, kde dochází k jejich separaci. Při průchodu septy vzorkovnice a chromatografu se vlákno zatáhne do jehly, která je chrání proti mechanickému poškození. Při vzorkování a chromatografické analýze je vlákno z jehly vysunuto. Jde o rychlou, jednoduchou metodu nevyžadující jakéhokoli použití rozpouštědla (10, 11, 12). V pivu byly SPME metodou stanoveny některé alkoholy, estery, dimethylsulfid, vicinální diketony, mastné kyseliny nebo karbonylové látky (13, 14, 15, 16, 17, 18).
Dalším rozvojem mikroextrakčních metod využívajících jako extrakční médium polydimethylsiloxanovou fázi se zabýval Baltussen a kol. (19). Na základě tohoto výzkumu představil novou extrakční techniku – extrakci na míchací tyčince (SBSE z anglického stir bar sorptive extraction).Tato technika je založena na stejných principech jako mikroextrakce na pevné fázi, ale tím, že je použito podstatně větší množství polydimethylsiloxanové fáze (50–300 μl), dochází k výrazně většímu obohacení organických sloučenin z extrahované matrice a v důsledku toho vzrůstá citlivost 100 až 1000krát.
V praxi je tedy magnetická tyčinka zatavena do skla, sklo je deaktivováno a pokryto polydimethylsiloxanovou fází. Výrobu si vzala pod svá křídla firma Gerstel, a prodává je pod názvem Twister. K dispozici jsou různé druhy Twisterů – délka 10 mm s tloušťkou fáze 0,5 mm nebo 1,0 mm, dále v délce 40 mm opět s tloušťkou fáze buď 0,5 mm nebo 1,0 mm. Ve všech případech je vnější průměr míchací tyčinky 3,2 mm.Twister o délce 10 mm se obvykle používá pro extrakci z objemu 1–50 ml, o délce 40 mm pro extrakci z objemů 100–250 ml (20).
Extrakce probíhá velmi jednoduše.Twister se vloží přímo do vzorku a nechá se míchat po dobu 30–120 min. Během této doby dochází k rozdělení analytů mezi matricí a polydimethylsiloxanovou fází Twisteru podle jejich rozdělovacích koeficientů. Potom je Twister vložen do termálního desorbéru, kde dojde k termální desorpci analytů (obvykle při teplotě 150–300 °C) a ty jsou pak bezprostředně separovány na plynovém chromatografu (20).
Pro stanovení velmi těkavých látek je možné využít headspace sorpční extrakci (HSSE). Tato technika, při které dochází k zakoncentrování analytů, je mnohem citlivější než klasická headspace metoda. Twister se vloží do speciálního držáčku a vše se umístí do uzavřené headspace vialky. Twister se tak nachází v parním prostoru nad vzorkem a analyty jsou extrahovány a zkoncentrovány v polydimethylsiloxanové fázi Twisteru (21).
V pivovarské analytice bylo techniky SBSE použito pro stanovení letinkové neboli sluneční příchutě (3-methyl-2-buten-1-thiol) a dalších sirných látek (22), hořkých kyselin v pivu metodou HPLC (23), karbonylových sloučenin (24).
Cílem této práce bylo vyzkoušet extrakci některých senzoricky aktivních látek z piva pomocí techniky extrakce na míchací tyčince. Po extrakci byly látky následovně zpětně extrahovány z polydimethylsiloxanové fáze do organického rozpouštědla a analyzovány na plynovém chromatografu s plamenoionizačním detektorem.
<h3>2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST</h3>
<h5>2.1 Použité chemikálie, standardy</h5>
Ethanol – Lach-Ner, s. r. o., ČR; methanol, hexan, dichlormethan – Merck, Německo; helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0 a synteproduct tický vzduch – Messer, ČR; ultračistá voda – Milli-RO 5plus firmy Millipore, USA.
Octan isoamylnatý, kapronan ethylnatý, kaprylan ethylnatý, octan fenylnatý, kaprinan ethylnatý, octan fenylethylnatý, lauran ethylnatý, myristan ethylnatý, palmitan ethylnatý – Sigma-Aldrich, USA.
<h5>2.2 Materiál a přístroje</h5>
Twister o délce 10 mm, vnějším průměru 3,2 mm a tloušťce polydimethylsiloxanové fáze 0,5 mm – Gerstel, Německo; 20 ml headspace vialky, 2 ml šroubovací vialky, 350 μl skleněné inserty, PTFE silikonová septa, víčka, uzavírací a otevírací kleště – CRS, USA; magnetické míchadlo – MLW RH3, Polsko; pinzeta – Chirana, ČR; plynový chromatograf CP 9001 – Chrompack, Holandsko; automatický dávkovač vzorků ASG 40 – Labio, ČR. 
<h5>2.3 Příprava vzorku</h5>
Před první aplikací a každým dalším použitím byl Twister kondicionován po dobu 1 h při teplotě 300 °C v atmosféře helia při průtoku 50 ml/min. Po vychladnutí na laboratorní teplotu byl Twister připraven pro další extrakci.
Zakoupené vzorky piv byly přechovávány v chladničce při teplotě 4 °C až do doby analýzy.Všechny pokusy vedoucí k optimalizaci podmínek stanovení a pro proměření kalibračních křivek byly prováděny na modelovém roztoku 5% obj. ethanolu ve vodě.
Do 20 ml headspace vialky bylo napipetováno 10 ml vzorku a do vzorku byl vložen Twister. Vialka byla uzavřena septem krytým hliníkovou folií a umístěna na magnetické míchadlo, kde byl vzorek míchán při 1200 min-1 za laboratorní teploty. Po skončení extrakce byl Twister opatrně pinzetou vyndán, krátce opláchnut redestilovanou vodou a osušen. Pro zpětnou extrakci analytů z polydimethylsiloxanové fáze byl Twister vložen do 350 μl skleněného insertu s 200 μl organického rozpouštědla. Tento insert byl umístěn do šroubovací vialky o objemu 2 ml a na magnetickém míchadle míchán při 1200 min-1. Po skončení extrakce z Twisteru byly 2 μl eluátu nastříknuty na kapilární kolonu plynového chromatografu.
<h5>2.4 Podmínky plynové chromatografie</h5>
Vlastní stanovení probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001, který byl opatřen automatickým dávkovačem vzorků Labio ASG 40.K separaci analytů byla použita 30 m dlouhá křemenná kapilární kolona ZB-WAX firmy Phenomenex s vnitřním průměrem 0,32 mm a tloušťkou filmu 0,25 μm. Kolona byla temperovaná na teplotu 80 °C po dobu 1 min, poté následoval teplotní gradient 8 °C/min do teploty 240 °C.Při této teplotě kolona zůstala po dobu 3 min.K nástřiku byl použit split/splitless injektor v režimu splitless. Split ventil byl otevřen po uplynutí 0,25 min. Injektor byl vyhříván na teplotu 260 °C, plamenoionizační detektor na teplotu 270 °C. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na kolonu byl 150 kPa při teplotě 80 °C.
<h3>3 VÝSLEDKY A DISKUSE</h3>
<h5>3.1 Optimalizace metody</h5>
Nejprve byl zkoumán vliv různých rozpouštědel na desorpci analytů z polydimethylsiloxanové fáze Twisteru. Byla odzkoušena tři různá rozpouštědla dichlormethan, směs dichlormethan:methanol v poměru 90:10 a dichlormethan:hexan v poměru 50:50. Jak vyplývá z obr. 1, součet ploch píků chromatografického záznamu všech stanovovaných látek byl největší pro směs dichlormethan: methanol v poměru 90:10. V této směsi rozpouštědel dosahovaly velkých odezev vyjádřených v plochách píků především těkavější sloučeniny jako octan isoamylnatý, kapronan ethylnatý a kaprylan ethylnatý, a to až o 36 % více než tytéž estery v druhém nejúčinnějším rozpouštědle dichlormethan:hexan v poměru 50:50. Zato méně těkavé analyty jako myristan ethylnatý a palmitan ethylnatý vykázaly větší odezvy v plochách píků o 10 % v rozpouštědle dichlormethan:hexan v poměru 50:50 na rozdíl od směsi dichlormethan: methanol v poměru 90:10. Vzhledem k tomu, že se tyto méně těkavé látky vyskytují v pivu v řádově nižších koncentracích než např. octan isoamylnatý, byla k dalším pokusům použita směs dichlormethan:hexan v poměru 50:50.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/fa35e5144b1a4726a6b37994d4a50f1f/obrazek.png" alt="Obr. 1 Vliv různých rozpouštědel na celkovou odezvu esterů při jejich desorpci z polydimethylsiloxanové fáze Twisteru (A – dichlormethan, B – dichlormethan:methanol 90:10, C – dichlormethan:hexan 50:50)"/>
Dále byl zjišťován vliv doby extrakce na velikost ploch píků stanovovaných látek. Jak ukazuje obr. 2, odezva sloučenin se podle očekávání zvětšovala s prodlužující se dobou extrakce.Těkavé látky, jako např. octan isoamylnatý, dosáhly saturace již po 45 min extrakce, delší doba extrakce, jako např. 120 min, znamenala pro tuto sloučeninu vzrůst odezvy jen o 1 %. Naproti tomu odezva palmitanu ethylnatého po 120 min extrakce se zvýšila o 42 % v porovnání s extrakcí trvající 60 min. Výše vroucí látky zřejmě pomaleji přecházejí do polydimethylsiloxanové fáze a potřebují tak delší čas k ustanovení rovnováhy. V praxi ale pro přesné stanovení není nezbytně nutné dosáhnout úplného rovnovážného stavu pro všechny stanovované sloučeniny. Na druhé straně, pokud by se extrahovalo pouze relativně krátkou dobu, nejen že by se snížila citlivost metody, ale také by se zhoršila opakovatelnost. Proto byla pro další experimenty zvolena extrakční doba 60 min.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/c9ae3d4b9c6f4d55afe6bf9cef692291/obrazek.png" alt="Obr. 2 Závislost délky doby vzorkování na extrakci některých esterů sorbovaných na Twister"/>
Vliv doby, po kterou byla prováděna zpětná extrakce stanovovaných látek z polydimethylsiloxanové vrstvy Twisteru do rozpouštědla, na celkovou velikost ploch píků všech sloučenin je zřejmý z obr. 3. Zpětná extrakce látek je zřejmě úplná již po 40 min.Ve srovnání s 20 min extrakce vzrostla při 40 min extrahování odezva octanu isoamylnatého o 28 %, odezva myristanu ethylnatého o 47 %. Naproti tomu vzrůst plochy píků při reextrakci trvající 60 min ve srovnání s dobou 40 min představoval jen 3 % pro octan isoamylnatý, pro lauran, myristan a palmitan ethylnatý byla velikost ploch píků dokonce &lt; 1 %. Proto v dalších pokusech byla prováděna zpětná extrakce po dobu 40 min.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/0cd82c7d2bcd440e812956181e2c2653/obrazek.png" alt="Obr. 3 Vliv délky doby, po kterou se provádí zpětná extrakce analytů z Twisteru do rozpouštědla, na velikost odezvy stanovovaných esterů"/>
Chromatografický záznam vzorku piva po sorpční extrakci na míchací tyčince je uveden na obr. 4. Je z něj patrná vyhovující separace všech stanovovaných látek prostá všech interferencí. Byly také provedeny analýzy extraktu z Twisteru po jeho rekondicionaci. Takto získané chromatografické záznamy nevykazovaly přítomnost žádné ze sledovaných analytů, a tak bylo potvrzeno, že výše popsaný postup rekondicionace Twisteru je dostačující.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/21da2dc0a9fd4a22a6621d4bd2975c70/obrazek.png" alt="Obr. 4 Chromatogram piva po sorpční extrakci na míchací tyčince. 1 – octan isoamylnatý, 2 – kapronan ethylnatý, 3 – kaprylan ethylnatý,
4 – octan fenylnatý, 5 – kaprinan ethylnatý, 6 – octan fenylethylnatý, 7 – lauran ethylnatý, 8 – myristan ethylnatý, 9 – palmitan ethylnatý"/>
<h5>3.2 Validace metody</h5>
Pro všechny stanovované sloučeniny byly proměřeny devítibodové kalibrační křivky v rozsahu koncentrací 0,015 mg/l až 30 mg/l v 5% obj. roztoku ethanolu. Výsledky jsou uvedeny v tab. 1. Lepší shody bylo dosaženo proložením jednotlivých kalibračních bodů kvadratickou křivkou namísto lineární regrese. Korelační koeficienty při lineární regresi byly lepší než 0,9988, při kvadratické lepší než 0,9995.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/4b55ca9f329a44b2af7e2dd034026b29/obrazek.png" alt="Tab. 1 Pracovní charakteristiky metody stanovení některých esterů po extrakci technikou sorpční extrakce na míchací tyčince"/>
Další pracovní charakteristiky metody jsou shrnuty v tab. 1. Správnost metody byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah stanovovaných esterů v pěti komerčních vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem sledovaných analytů na koncentrační hladině 7,5 mg/l. Výtěžnosti se pohybovaly od 78–107 %. Opakovatelnost metody byla zjištěna opakovanou sorpční extrakcí na míchací tyčince jednoho a téhož vzorku piva (pětkrát během jednoho dne). Relativní směrodatné odchylky se nacházely v intervalu 2,1–7,3 %.
<h3>4 ZÁVĚR</h3>
Bylo dokázáno, že pro stanovení některých, především méně těkavých esterů (octan isoamylnatý, kapronan ethylnatý, kaprylan ethylnatý, octan fenylnatý, kaprinan ethylnatý, octan fenylethylnatý, lauran ethylnatý, myristan ethylnatý a palmitan ethylnatý) v pivu majících vliv na senzorickou kvalitu výrobku je sorpční extrakce na míchací tyčince následovaná zpětnou extrakcí analytů z polydimethylsiloxanové fáze do organického rozpouštědla velmi vhodnou alternativou ke klasickým technikám jako je destilace s vodní párou následovaná extrakcí v systému kapalina-kapalina nebo SPE a SPME. Pro stanovení esterů v pivu tímto postupem byly na základě provedených experimentů navrženy tyto pracovní podmínky: 10 ml vzorku extrahovat Twisterem (délka 10 mm, tloušťka polydimethylsiloxanové fáze 0,5 mm) při 1200 ot/min po dobu 1 h, zpětnou extrakci analytů z Twisteru provést v 200 μl směsi rozpouštědel dichlormethan:hexan v poměru 50:50 při 1200 ot/min po dobu 40 min.
V porovnání s postupy využívajícími sorpční extrakce na míchací tyčince v kombinaci s termální desorpcí odpadá při zpětné extrakci do rozpouštědla nutnost pořídit finančně velmi náročný termální desorbér. Popsaná metoda je tedy levná, jednoduchá, používá malé množství vzorku, pouze mikrolitry organického rozpouštědla a vyznačuje se příznivými pracovními charakteristikami.

Extrakce na míchací tyčince – nová možnost při analýze některých senzoricky a aktivních látek v pivu

Již téměř 20 let je známo, že pokud jsou nealkoholické nápoje konzervovány kyselinou benzoovou, může tato kyselina reagovat s kyselinou askorbovou za vzniku karcinogenního benzenu. Zjištěné koncentrace benzenu ve 49 nealkoholických nápojích zakoupených v české tžní síti, analyzovaných v rámci pětiletého průzkumu, byly vždy nižší než 10 μg∙l⁻¹; průměrný obsah benzenu byl okolo 1 μg∙l⁻¹. Studie ukázala, že obsah benzenu není snadné předvídat. Ze sledovaných složek nápoje (benzoát, askorbová kyselina, sladidla, minerály, CO2) byla prokázána významná pozitivní korelace pouze mezi obsahem benzenu a benzoátu. Zdá se, že více než složení ovlivňují pozitivní nálezy benzenu v nápojích vnější kontaminace surovin a podmínky skladování.
<h3>1 ÚVOD</h3>
Od roku 1991 je známo, že pokud jsou nealkoholické nápoje konzervovány benzoovou kyselinou (benzoát sodný), reaguje tato látka za určitých podmínek s askorbovou kyselinou (vitamin C) nebo erythorbovou kyselinou (isomer vitaminu C) za vzniku karcinogenního benzenu (Nyman et al., 2008).
Askorbová kyselina interaguje s benzoovou kyselinou v přítomnosti přechodných kovů, tj. s Cu (II) a Fe (III) ionty, podle následujícího mechanismu: O2 může být redukován pomocí askorbové kyseliny na superoxidový anion radikál, z něhož spontánně vzniká peroxid vodíku (H₂O₂); následně může askorbová kyselina redukovat peroxid vodíku za tvorby hydroxylového radikálu způsobujícího dekarboxylaci benzoátu sodného na benzen. Vznik benzenu je primárně ovlivňován pH, UV zářením a teplotou (Lachenmeier et al., 2008; Gardner a Lawrence, 1993; Adams, 1997). Naopak sladidla, např. cukr, fruktosovo-kukuřičný nebo škrobový sirup, a chelatační činidla mohou reakci inhibovat. Tvorba benzenu v nealkoholických nápojích tedy závisí na složení výrobku a podmínkách skladování (ICBA, 2006). V roce 1987 byl benzen klasifikován jako lidský karcinogen (skupina 1) (Gardner a Lawrence, 1993; IARC, 1987). Většina z denního příjmu benzenu pochází z ovzduší buď z přírodních zdrojů (lesní požáry, prosakování nafty), nebo z lidské činnosti, jako je kouření nebo výfukové plyny (Wallace et al., 1993).
Denní expozice benzenem pro nekuřáky je stanovena na 200 až 450 μg∙den⁻¹ (WHO, 1996). Do potravin se benzen může dostat prostřednictvím následujících zdrojů: obalový materiál, skladovací prostředí, znečištění vodních zdrojů, kontaminovaný CO₂ používaný pro sycení, rozklad nebo reakce konzervačních látek, postupy vaření a ozařovací techniky využívané pro sterilaci (Ridgway et al., 2007; Fabietti et al., 2001).
Obsah benzenu v potravinách a nápojích byl již stanovován v rámci řady studií. Nejvyšší koncentrace byly nalezeny v jamajském rumu (120 μg∙l⁻¹), ozářeném hovězím mase (19 μg∙kg⁻¹), vejcích (500–1 900 μg∙kg⁻¹), ústřicích (220–260 μg∙kg⁻¹) a rybách (3–88 μg∙kg⁻¹) (Wallace et al., 1993; WHO, 1993; U.S. HHS, 1997; U.S. HHS, 2011).
Byly stanoveny následující maximální limity pro benzen jako kontaminant pitné vody: 1.0 μg∙l⁻¹ (Evropská unie) a 10 μg∙l⁻¹ (Světová zdravotnická organizace). Nicméně, doposud nebyl určen zákonný limit pro benzen v potravinářských výrobcích a nápojích (nealkoholických nápojích) (WHO, 1996; EC, 1998). 
V letech 2005–2007 byly provedeny dva velké průzkumy (Spojené státy americké), v rámci nichž bylo analyzováno téměř 200 vzorků nealkoholických nápojů (tab. 1) (U.S. FDA, 2007). U většiny vzorků byly koncentrace benzenu stanoveny nižší než 1 μg∙l⁻¹ nebo pod mezí detekce; 93 % vzorků obsahovalo benzen v koncentracích nižších než 10 μg∙l⁻¹.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/faf2b2bb25574bc2b333050f8270e05f/obrazek.png" alt="Tab. 1 Data k obsahu benzenu v nealkoholických nápojích (výzkum Amerického úřadu pro kontrolu potravin a léčiv v období od listopadu
2005 do 20. dubna 2006 a od 21. dubna 2006 do 16. května 2007); n = počet výrobků; n.d. = nedetekováno; *místo kyseliny askrobové může obsahovat jiné deriváty jako jsou kyselina erythorbová nebo askorbát "/>
V roce 2008 bylo analyzováno téměř 450 vzorků nealkoholických nápojů v rámci dalších dvou rozsáhlých studií (Belgie a Německo); pro většinu vzorků se koncentrace benzenu pohybovala pod limitem 1 μg∙l⁻¹ nebo pod mezí detekce a pouze v 0,4 % (2 případy) byla stanovena nad 10 μg∙l⁻¹ (Lachenmeier et al., 2008; Poucke et al., 2008). 
Od roku 2010 nebyly provedeny žádné velké průzkumy zaměřené na nealkoholické nápoje. K dispozici jsou po roce 2010 pouze data ze studie provedené v roce 2012, která byla zaměřena na analýzu potravin a nápojů na belgickém trhu; bylo analyzováno 52 vzorků nealkoholických nápojů a zjištěné koncentrace benzenu byly v rozmezí od nedetekováno do 11,5 μg∙l⁻¹ (Vinci et al., 2012). Žádná z výše uvedených prací nezahrnovala vzorky z České republiky nebo střední a východní Evropy.
V naší studii jsme se zaměřili na trendy v posledních letech, týkající se změny receptury produktu z hlediska koncentrace prekurzorů benzenu a vyhodnocení faktorů potlačujících a podporujících vznik benzenu v nealkoholických nápojích českého původu.
<h3>2 MATERIÁL A METODY</h3>
<h5>2.1 Chemikálie</h5>
Benzen (p.a., Penta), benzen-d6 (2 000 μg∙ml⁻¹ v methanolu, Sigma-Aldrich, Německo), methanol, benzoát sodný standard a askorbová kyselina (p.a., Sigma-Aldrich, Německo), kyselina sírová (p.a., Lachner), L-cystein a šťavelová kyselina (p.a., Sigma-Aldrich, Německo) byly zakoupeny komerčně.
<h5>2.2 Vzorky</h5>
Bylo analyzováno dvacet tři vzorků nealkoholických nápojů v roce 2006 (tab. 2) a dvacet šest vzorků nealkoholických nápojů v roce 2011 (tab. 3). Všechny z nich pocházely z obchodní sítě v Praze a byly vyrobeny různými společnostmi. Vzorky byly skladovány při teplotě 6 °C. Všechny nápoje byly analyzovány v první čtvrtině garantované doby trvanlivosti.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2460d2b7ce7647509ca643a869b9b233/obrazek.png" alt="Tab.2 Přehled vzorků, 2006 (přítomnost benzoátu sodného, kyseliny askorbové a ovocného podílu uvedených na etiketě analyzovaných
nelakoholických nápojů); × znamená deklarovanou přítomnost benzoátu sodného a askorbové kyseliny; – znamená nedeklarováno"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/829e0b874e914fd7bd4d0a14fdf968cc/obrazek.png" alt="Tab. 3 Přehled vzorků, 2011 (přítomnost benzoátu sodného, askorbové kyseliny a ovocného podílu uvedených na etiketě analyzovaných
nelakoholických nápojů); × znamená deklarovanou přítomnost benzoátu sodného a askorbové kyseliny; – znamená nedeklarováno"/>
Skladovací experiment byl proveden pro jeden z výše uvedených výrobků (složení: minerální voda, cukr, aroma, citronová kyselina, benzoát sodný, dimethyldikarbonát, askorbová kyselina): neotevřené komerční lahve ze tří šarží nealkoholického nápoje byly udržovány při pokojové teplotě (20 ± 1 °C) za viditelného světla (přibližně 10 h∙d⁻¹) po dobu šesti měsíců.
<h5>2.3 Stanovení benzenu</h5>
K mikroextrakci tuhou fází (SPME) bylo využito 50/30 μm DVB/ CAR/PDMS vlákno (Supelco Inc., Belefonte, USA). Obsah benzenu byl stanoven pomocí GC 6890N s kvadrupólovým hmotnostním detektorem MS 5973 (Agilent Technologies, USA) a DB-5MS kolonou (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm; Agilent JW Scientific, USA).
Zásobní standardy benzenu a benzenu-d6 (oba 0,002 g∙l⁻¹) byly připraveny v methanolu. Sycené vzorky byly před analýzou odplyněny po dobu 1,5 min v ultrazvukové lázni. 5 ml z každého vzorku bylo převedeno do 10 ml vialky, do každé z nich byl přidán vnitřní standard benzen-d6 (5 μl zásobního roztoku). Vzorky byly temperovány 10 min při teplotě 60 °C; pro vlastní extrakci bylo vlákno vsunuto do headspace prostoru vialky a vzorek byl míchán při 500 rpm po dobu 5 min při teplotě 60 °C.
Separační chromatografické podmínky byly následující: počáteční teplota kolony 45 °C (5 min), nárůst teploty na 200 °C rychlostí 25 °C∙min⁻¹ (1 min). Teplota injektoru byla nastavena na 200 °C (dělicí poměr 30:1), iontový zdroj a MS kvadrupól na teplotu 230 °C a 150 °C; desorpce po dobu 5 min, konstantní průtok He 0,7 ml min-1. Pro detekci benzenu byl využit SIM mód (m/z 78, 77 pro benzen a 84, 82 pro benzen-d₆).
<h5>2.4 Stanovení benzoové kyseliny (jako benzoátu sodného) a askorbové kyseliny (askorbové a dehydroaskorbové)</h5>
Pro stanovení benzoové kyseliny byly vzorky zředěny destilovanou vodou, filtrovány a následně nastříknuty (20 μl) do HPLC. Teplota kolony (Rezex RFQ-Fast Fruit H + (8%, 100 x 7,8 mm, 8 μm, Phenomenex, Chromservis, ČR) byla udržována na 50 °C. Mobilní fáze se skládala z kyseliny sírové (0,05 mol∙l⁻¹) v methanolu (10%), přičemž průtok byl 1 ml∙min⁻¹. Detekce probíhala při 233 nm.
Askorbová kyselina byla stanovena po zředění vzorku destilovanou vodou s L-cysteinem (0,1%) a šťavelovou kyselinou (1% ) pomocí HPLC podle Rajchl et al. (2010).
Obě HPLC analýzy byly provedeny na sestavě Dionex HPLC/UV/VIS (AMEDIS, ČR).
<h5>2.5 Statistická analýza</h5>
Pro každý vzorek byly provedeny 3 stanovení a byly uvedeny průměrné hodnoty; pro vyhodnocení byly použity programy Statistica 8.0 (StatSoft ČR s.r.o., Praha, ČR) a Excel 2010 (Microsoft Corporation).
<h3>3 VÝSLEDKY A DISKUSE</h3>
<h5>3.1 Validace metody</h5>
Pro benzen bylo posuzováno pět validačních parametrů: relativní směrodatná odchylka měření (opakovatelnost) byla 6,3 %, linearita byla 1,0–50 μg∙l⁻¹, mez detekce (LOD) byla 0,1 μg∙l⁻¹ a mez kvantifikace (LOQ) 1,0 μg∙l⁻¹. Výtěžnost benzenu byla zjištěna u „spikovaného“ (fortifikace vzorku standardem) nápoje s obsahem benzenu 1 μg∙l⁻¹ a 10 μg∙l⁻¹ na 91 % a 98 %.
<h5>3.2 Výsledky studie</h5>
Poté, co se Americký úřad pro kontrolu potravin a léčiv začal v roce 2005 zabývat opětovným výskytem benzenu v nealkoholických nápojích (Nyman et al., 2008), jsme se rozhodli prozkoumat situaci v České republice. V roce 2006 jsme analyzovali 23 vzorků z trhu (ochucené vody, ovocné a jiné nápoje), z toho 15 vzorků mělo deklarovaný obsah benzoátu a askorbové kyseliny na etiketě výrobku. Data pro výše zmíněné vzorky jsou shrnuta na obr. 1. Benzen byl identifikován v 17 vzorcích (74 %). Koncentrace benzenu u sedmi vzorků překročila přípustný limit pro vodu (1 μg∙l⁻¹); v těchto případech se koncentrace benzenu pohybovala v rozmezí od 1,1 až 3,2 μg∙l⁻¹; všechny tyto vzorky obsahovaly jak benzoát, tak askorbovou kyselinu. Korelace obsahu benzenu s obsahem benzoátu sodného a askorbové kyseliny ale nebyla statisticky signifikantní. Další faktory, které jsou uvedeny v literatuře jako promotory vzniku benzenu, např. přítomnost umělých sladidel, CO₂, vyšší obsah minerálních látek v důsledku použití minerální vody nebo ovocný obsah, také nebyly potvrzeny.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/eba02f2566694c4b9c0abfeb05e1ca63/obrazek.png" alt="Obr. 1 Přehled výsledků, přítomnost benzoátu sodného, askorbové kyseliny (jak je uvedeno na etiketě) a benzenu v analyzovaných nealkoholických nápojích (2006)"/>
Po skandálu v roce 2006 (ICBA, 2006; U.S. FDA, 2007) vyvstala otázka, zda výrobci reagovali úpravou svých receptur z pohledu eliminace přítomnosti benzenu. Což se do určité míry potvrdilo (U.S. FDA, 2007), avšak na trhu se objevili také výrobci noví a i jiní začali fortifikovat své produkty askorbovou kyselinou a ostatními nutrienty v reakci na poptávku konzumentů po zdravějších výrobcích. V roce 2011 jsme zopakovali průzkum trhu, stanovovali jsme obsah benzenu u 26 nealkoholických nápojů, z nichž 12 bylo buď nakoupených pod stejnými obchodními názvy jako v průzkumu v roce 2006, nebo byly zakoupeny výrobky s obdobným složením od stejného výrobce. Výsledky získané pro tyto vzorky jsou shrnuty na obr. 2 (označení prvních dvanácti vzorků odpovídá vzorkům na obr. 1). Devatenáct vzorků (73 %) obsahovalo detekovatelné koncentrace benzenu; jedenáct z nich bylo nad limit Evropské unie pro benzen v pitné vodě (1 μg∙l⁻¹) (ES, 1998), ale žádný z nich nebyl vyšší než limit Světové zdravotnické organice (10 μg∙l⁻¹) pro benzen v pitné vodě (WHO, 1996).
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/5562c92096b74bfda10e92c3331859e8/obrazek.png" alt="Obr. 2 Přehled výsledků, přítomnost benzoátu sodného, askorbové kyseliny (jak je uvedeno na etiketě) a benzenu v analyzovaných nealkoholických nápojích (2011)"/>
Shrneme-li výsledky z let 2006 a 2011, měřitelné koncentrace benzenu byly stanoveny u 73 % vzorků (36 ze 49), část z těchto vzorků (13 výrobků) však neobsahovala současně benzoát a askorbovou kyselinu, což poukazuje na jiný zdroj kontaminace benzenem. Zároveň bylo zjištěno, že u 10 % vzorků (5 ze 49) s obsahem benzoátu, askorbové kyseliny i stopových množství přechodných kovů jako katalyzátorů reakce, nebyl identifikován žádný benzen, ačkoliv s ohledem na druh a složení nápoje by jeho vznik mohl být očekáván. Grafické vyjádření statistického zpracování výsledků (analýza hlavních komponent) je zobrazeno na obr. 3. Obrázek poukazuje na korelaci mezi jednotlivými složkami a benzenem. Jediná významná pozitivní korelace byla zjištěna mezi obsahem benzenu a obsahem benzoátu sodného. Zdá se, že více než složení způsobují pozitivní nálezy benzenu vnější kontaminace surovin a podmínky skladování (čas, teplota, UV záření), což koresponduje s literaturou (Nyman et al., 2010).
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/1674d37344b1423b882d7220db35b0da/obrazek.png" alt="Obr. 3 Analýza hlavních komponent – korelace proměnných"/>
Skutečnost, že všechny komerční vzorky zahrnuté do průzkumu byly analyzovány v první čtvrtině jejich garantované doby trvanlivosti, by mohla být důvodem ke vzniku relativně zanedbatelných koncentrací benzenu. Proto jsme se rozhodli otestovat vliv podmínek skladování na obsah benzenu a ve spolupráci s jedním z největších tuzemských výrobců byly provedeny neurychlené skladovací experimenty zaměřené na tvorbu benzenu. Kinetika tvorby benzenu během 6 měsíců v nápojích obsahujících oba prekurzory a mineralizovanou vodu je znázorněna na obr. 4. Za optimálních podmínek (Cu a Fe ionty z minerální vody, UV záření, pokojová teplota) byl pozorován nárůst koncentrace benzenu z nuly na téměř 4 μg∙l⁻¹.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/7a73b8c06ca7418b8a4ef3525cf20415/obrazek.png" alt="Obr. 4 Skladovací experiment nealkoholických nápojů (průměrné hodnoty ze tří nezávislých měření)"/>
<h3>4 Závěr</h3>
Koncentrace benzenu ve všech 49 reálných vzorcích byla nižší než 10 μ g∙l⁻¹, výsledky průzkumu odpovídají celosvětové situaci. Přestože od roku 2006 někteří výrobci zodpovědně minimalizovali přítomnost benzenu ve svých nápojích díky přeformulování receptur výrobků, průměrný obsah benzenu zůstává stejný okolo 1 μg∙l⁻¹. Studie ukázala, že obsah benzenu není snadné předvídat, ale pokud jsou prekurzory přítomny ve výrobku, existuje vždy vysoká pravděpodobnost vzniku benzenu. Ačkoliv ve srovnání s jinými zdroji expozice je příjem benzenu z nealkoholických nápojů zanedbatelný, lze výrobcům doporučit provádět specifické testy skladovatelnosti pro každý produkt s obsahem jak přírodní kyseliny benzoové a askorbové, tak v případě jejich použití jako aditiva.

Průzkum obsahu benzenu v nealkoholických nápojích

V souvislosti se zvyšujícími se nároky na rychlost analýz v analytických laboratořích dochází k neustálému zlepšování instrumentálních technik. Článek se zabývá pokroky v nejrozšířenější separační technice, a to v kapalinové chromatografii. Její zcela nová modifikace, ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC), využívá principu separace na porézních částicích menších než 2 μm. Výhody UHPLC oproti klasické HPLC jsou až devítinásobné zkrácení doby analýzy, dvojnásobné zlepšení rozlišení a trojnásobné zlepšení citlivosti. To vede nejen k ohromné úspoře času, ale také nákladů na energii a organická rozpouštědla a jejich ekologickou likvidaci. Alternativou k UHPLC technice je použití kolon s povrchově porézními částicemi nebo kolon monolitních. UHPLC již našla své uplatnění také v pivovarské analytice.
<h3>1 ÚVOD</h3>
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) patří mezi nejvíce rozšířené separační techniky běžně využívané v oblastech, jako jsou farmakologie, toxikologie, klinická analýza, dále v různých vědních oborech (Stroh et al. 2008, Pratet et al. 2004, Klein et Rivera 2004), a v neposlední řadě při analýze potravin, konkrétně piva a jeho surovin (např. Čulík et al. 2009).
V souvislosti se zvyšujícími se nároky na vysokou průchodnost vzorku laboratoří (jinými slovy počtem analýz za časovou jednotku) dochází k neustálému vývoji analytických technik. Také v oblasti HPLC došlo za poslední desetiletí k vývoji směrem k „rychlejším“ analýzám. Existují v podstatě dva základní přístupy k „rychlé chromatografii“. První vede k vývoji zcela nové generace chromatografických kolon a s tím i spojené instrumentace, operující při maximálních tlacích 100 MPa (15 000 PSI) (Swartz 2005). Pro tuto metodu byl zaveden a přijat název Ultra účinná kapalinová chromatografie (UHPLC). Druhý přístup zachovává klasickou HPLC instrumentaci, která pracuje při tlacích 40 MPa (6000 PSI), čemuž ovšem vyhovují jenom novější typy přístrojů. Zrychlení analýzy je v tomto případě zajištěno použitím speciálních kolon, zejména kolon monolitních a kolon s povrchově porézními částicemi.
<h3>2 UHPLC – ULTRA ÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE</h3>
Složitý proces chromatografické separace je dán souborem interakcí analytu mezi mobilní fází (rozpouštědlem) a stacionární fází (zjednodušeně náplní kolony). Při průchodu analytu chromatografickou kolonou je analyt unášen mobilní fází, ke které má specifickou afinitu (je v ní rozpustný) a dále interaguje s fází stacionární (přenos hmoty). Kontakt analytu se stacionární fází je zprostředkován „difuzí“. Tu rozlišujeme u chromatografického procesu trojího druhu, difuzi podélnou (pohyb částic analytu v mobilní fázi), vířivou (pohyb částic analytu k povrchu částic stacionární fáze a zpět) a difuzi uvnitř pórů částic v různých směrech (transport hmoty analytu do stacionární fáze a zpět). Matematické vyjádření součtu jednotlivých příspěvků difuze nazýváme jako van Deemterova rovnice
H = a(dp) + b/u + c(dp)²u
která udává vztah mezi výškou teoretického patra H kolony (v převrácené hodnotě účinností kolony) a mezi lineární průtokovou rychlostí u mobilní fáze. Příspěvek a (podélná difuze) je ovlivněn pouze velikostí částic, příspěvek b (vířivá difuze) je nepřímo úměrná lineární průtokové rychlosti u a příspěvek c (difuze uvnitř pórů částic) je přímo úměrný lineární průtokové rychlosti a druhé mocnině velikosti částic stacionární fáze.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obr_1_Van_Deemterova_krivka_pro_castice_o_prumeru_10_5_3_a_1_7_mm_bc7d9c667a/Obr.-1-Van-Deemterova-krivka-pro-castice-o-prumeru-10-5-3-a-17-mm.jpg" alt="Obr. 1 Van Deemterova křivka pro částice o průměru 10, 5, 3 a 1,7 μm"/>
Od 70. let, kdy se v náplňových kolonách používaly částice o průměru 10 μm, došlo k ohromnému pokroku při vývoji technologií pro přípravu stále menších částic, a tudíž ke zlepšování parametrů separace. Na obr. 1 jsou znázorněny van Deemterovy křivky pro čtyři různé velikosti běžně používaných částic 10, 5 a 3 μm a nově 1,7 μm. Z něho vyplývá, že se snižujícím se průměrem částic roste účinnost separace (neboli zmenšuje se výška teoretického patra H). To je dáno skutečností, že při redukci částic zlepšíme převod hmoty, tím potlačíme rozmývání, neboli zvýšíme účinnost. Přitom lze při použití takto malých částic účinnosti dosáhnout při mnohem vyšších průtokových rychlostech, což má za následek rychlejší separaci. Této skutečnosti bylo využito při vývoji zcela nových částic, v angl. Literatuře označovaných jako„sub-2 μm“ (Mellors et Jorgenson 2004), a to dalo impuls ke vzniku nové generace kapalinové chromatografie – Ultra účinné kapalinové chromatografie (UHPLC). Díky této technologii lze zkrátit analýzy až devětkrát, citlivost zlepšit třikrát a dvakrát lze zlepšit rozlišení. Takové zrychlení se projeví nejen v úspoře energie a člověkohodiny, ale také v téměř desetinásobné úspoře organických rozpouštědel, a tedy i v nákladech na jejich bezpečnou likvidaci. Tuto bilanci společně s porovnáním obecného HPLC a UHPLC chromatogramu znázorňuje obr. 2. Je nutno zdůraznit, že kolony naplněné sorbentem s tak malým průměrem částic generují mnohonásobně vyšší zpětný tlak, než běžné chromatografické kolony, proto musel být těmto tlakům uzpůsoben zcela nově celý UHPLC instrument, který je schopen při tak vysokých tlacích (100 MPa, 15000 PSI) pracovat.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obr_2_Porovnani_HPLC_a_UHPLC_chromatogramu_884f392190/Obr.-2-Porovnani-HPLC-a-UHPLC-chromatogramu.jpg" alt="Obr. 2 Porovnání HPLC a UHPLC chromatogramu (v tabulce je uveden výčet vylepšených parametrů UHPLC oproti HPLC)"/>
Obr. 3 pro ilustraci znázorňuje, jak malé jsou nové 1,7 μm částice v porovnání s běžnou částicí 5 μm a s průměrem lidského vlasu (60 μm).
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obr_3_Srovnani_velikosti_hybridni_1_7_mm_castice_afd22180e8/Obr.-3-Srovnani-velikosti-hybridni-17-mm-castice.jpg" alt="Obr. 3 Srovnání velikosti hybridní 1,7 μm částice (C) s velikostí běžné 5 μm částice (A) a průměrem lidského vlasu 60 μm (B)"/>
První informace zahrnující princip UHPLC (Schwartz 2005), jeho spojení s UV a MS detektorem (Plumb et al. 2004), popis nového typu „sub-2 μm“ částic a s tím související chemickou podstatou a technologií výroby nových UPLCTM kolon, byly uveřejněny v roce 2004 (Mellors 2004). Tyto kolony, Acquity UPLC BEH C18 (Waters) s průměrem částic 1,7 μm, jsou založeny na BEH technologii (z angl. bridged ethylene hybrid) (Swartz et Murphy 2005). Mezi silanolové skupiny jsou vloženy hybridní ethylenové můstky (viz obr. 4), které fungují jednak jako endkapingové skupiny a navíc zpevňují celkovou strukturu takto připravené silikagelové fáze. To udává kolonám jak vysokou mechanickou odolnost (max. tlak 15 000 PSI), tak i vysokou odolnost chemickou, a proto můžeme na takovýchto kolonách měřit v širokém rozsahu pH. V alkalické oblasti je to až do pH cca 12, v kyselé oblasti mají tyto kolony stabilitu v závislosti na použitém ligandu, a to v oblasti pH 1-2. Navíc jsou odolné vůči jevu zvanému „krvácení kolony“ (angl. bleeding), neboli vymývání ligandu z nosné fáze. V současné době je již na trhu celá škála UHPLC kolon se všemi obvyklými ligandy, např. BEH C18 a C8 (nerozvětvený alkylový řetězec pro klasickou reverzní chromatografii), BEH Shield RP18 (alkylový řetězec s vloženou polární, karbamátovou skupinou, kombinuje hydrofobní a hydrofilní vlastnosti kolony, vhodná pro polyfenolické látky), BEH Phenyl (fenylový ligand ukotvený na C6 alkylu, vhodné pro látky s benzenovým jádrem), BEH Amidová kolona (amidová skupina, dobře zadržuje látky, které jsou pro reverzní chromatografii již moc polární), BEH HILIC (BEH částice bez ligandu, vhodné pro velmi polární látky), pro eluci využívá vodných fází s malými obsahy organického modifikátoru) a mnoho dalších. Délka těchto kolon je 2, 3, 5, 10 a 15 cm, nejčastěji se používají kolony o délce 5 cm. Průměr kolony pro spojení s UV detektorem je nejčastěji 2,1 mm, pro spojení s MS detektorem 1 mm. Tak jako je tomu u klasické chromatografie, je kolona chráněna předkolonkou a navíc speciálním filtrem, který kolonu chrání před případnými nečistotami z mobilní fáze. Malý průměr částic v koloně klade vysoké nároky jak na přípravu mobilní fáze, kterou je nutno předem filtrovat přes membránový filtr 0,2 μm, tak na přípravu vzorku, který je nutno před dávkováním na kolonu filtrovat nebo centrifugovat.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obr_4_Znazorneni_chemicke_struktury_hybridni_BEH_castice_1ef4bff896/Obr.-4.-Znazorneni-chemicke-struktury-hybridni-BEH-castice.jpg" alt="Obr. 4. Znázornění chemické struktury hybridní BEH částice s hybridními ethylenovými můstky"/>
O skutečnosti, že byl nový princip UHPLC všeobecně přijat mezi analytickou veřejností, svědčí nejen stoupající počet výrobců UHPLC kolon s částicemi 1,5–2 μm (např. Waters – Acquity BEH kolony, Restek – Pinnacle® DB kolony, Grace – Vision HT kolony, Thermo Scientific – Hypersil GOLD, Agilent – Eclipse Plus C18 a StableBond SB-C18, Perkin Elmer – Brownlee Analytical DB C18), ale i počet výrobců UHPLC chromatografů. Kromě firmy Waters (chromatograf Acquity), která danou technologii jako první vyvinula, dodávají dnes na trh chromatografy s podobnými vlastnostmi např. firmy Agilent (1200RRLC, Infinity), ThermoElectron (Acella High Speed), Shimadzu (ProminenceUFLC), Dionex (RSLC UltiMAte 3000), Perkin Elmer (Flexar) a další. V literatuře lze nalézt dvě označení pro ultraúčinnou chromatografii UPLC a UHPLC, která lze považovat za synonyma. Jelikož technologii UPLC uvedla poprvé na trh firma Waters, která si zkratku UPLCTM ochránila jako „trade mark“, obecně se pro tuto technologii, přístroje a kolony dalších výrobců přijalo společné označení UHPLC.
Přednosti UHPLC byly využity i při analýzách piva a pivovarských surovin a řada těchto aplikací je výsledkem vědecké práce kolektivu autorů z VÚPS, a.s. Nejnovější aplikací, publikovanou v mezinárodním vědeckém časopisu v roce 2011, je stanovení ochratoxinu A v pivovarských surovinách, pivu (Běláková et al. 2011) a také ve vínu. Převedením původní metodiky HPLC na UHPLC se redukovala doba analýzy z původních 10 min na 2 min. Stejně je tomu tak i v metodě stanovení kyseliny ferulové v ječmeni a sladu (Běláková et al. 2010), kde byla původní doba analýzy 12 min zkrácena na pouhé 2 min. Stejný kolektiv autorů vyvinul řadu dalších UHPLC metodik, které patří do souboru metod VÚPS, a.s. Jsou to kromě stanovení zmíněné kys. ferulové i ostatní fenolické kyseliny (kumarová apod.), dále stanovení vitaminů E a skupiny B v pivu a pivovarských surovinách, stanovení patulinu v pivu a jeho surovinách, v nealko nápojích i víně, anebo silymarinu v extraktu Ostropestřce.
V dalších číslech časopisu uvedeme podrobnější srovnání HPLC a UHPLC na příkladech stanovení α- a β-hořkých kyselin ve chmelu a chmelových preparátech a stanovení cis/transizomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodami UHPLC, které byly vyvinuty na VÚPS, a.s.
<h3>3 KOLONY S POVRCHOVĚ PORÉZNÍMI ČÁSTICEMI</h3>
V případě, že uživatel nemá možnost investovat do nového UHPLC přístroje a nechce si pořizovat nový chromatograf, ale použít HPLC přístroj stávající, má alternativní možnost, jak zrychlit chromatografický proces. V takovém případě může pro separaci použít chromatografické kolony s tzv. „povrchově porézními částicemi“, v angličtině označovaných jako „fused-core silica“ nebo „coreshell particles“. Tyto kolony pracují při běžných tlacích (max asi 6000 PSI), a jsou tedy s většinou HPLC instrumentů kompatibilní. Částice, jak je znázorněno na obr. 5, jsou tvořeny pevným jádrem o průměru asi 1,7 μm a porézní silikagelovou slupkou o hloubce asi 0,5 μm (tyto rozměry se liší ± 0,1 μm podle výrobce), v jejíchž pórech dochází k difuzi analytu a přenosu hmoty. Jelikož celkový průměr částic je 2,7 μm, negenerují tyto částice v koloně tak veliký odpor jako „sub-2 částice“. Přitom je hloubka porézní slupky srovnatelná s průměrem „sub-2 částic“. To se projeví ve srovnatelných separačních vlastnostech neboli ve srovnatelné účinnosti a rozlišení v porovnání s UHPLC. To, že analyt nemusí difundovat díky rigidnímu jádru skrz celou částici, zkrátí jeho dráhu a tedy prodlevu v koloně, což má za následek zrychlení analýzy při zachování parametrů separace.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obr_5_Castice_s_porezni_vrstvou_tvorena_pevnym_jadrem_e90c1330c0/Obr.-5-Castice-s-porezni-vrstvou-tvorena-pevnym-jadrem.jpg" alt="Obr. 5 Částice s porézní vrstvou tvořená pevným jádrem (1,7 μm) a tenkou porézní vrstvou (0,5 μm)"/>
Od roku 2010 bylo vydáno mnoho prací, které potvrzují, že kolony s povrchově porézními částicemi našly v praxi vysoké uplatnění, a že jsou jejich separační schopnosti téměř srovnatelné se „sub-2 částicemi“ (Abrahim et al. 2010, Tylová et al. 2011). Tyto kolony, např. Halo (Mac-Mod Analytical), Ascentis Express (Sigma-Aldrich), Kinetex (Phenomenex) a nebo Poroshell (Agilent), jsou již dostupné v široké škále běžných ligandů. Příkladem využití v potraviná řské analytice je stanovení chinolonů ve vejcích, metoda byla díky použití kolony Kinetex dvakrát zrychlena (Jiménez et al. 2011). V analytice piva a jeho surovin je první aplikací na koloně Kinetex (2,6 μm) rychlé stanovení iso-alfa-hořkých kyselin a některých redukovaných forem tetrahydroiso-alfa kyselin (Koerner et al. 2011).
<h3>4 MONOLITNÍ KOLONY</h3>
Dalším a v posledních letech rozšířeným způsobem, jak urychlit chromatografický proces, je použití monolitních kolon. Na rozdíl od konvenčních stacionárních fází, které jsou tvořeny jednotlivými částicemi sorbentu o definované velikosti, monolitické HPLC kolony tvoří jediný kus pórovitého materiálu, který zcela zaplňuje vnitřek separační kolony. Oproti typickým kolonám plněným částicemi, monolity neobsahují mezičásticové prostory, kterými se v kolonách uskutečňuje značná část průtoku. Proto musí mobilní fáze protékat póry monolitu, které jsou mnohem větší, než běžné póry v kolonách plněných částicemi. Monolitické kolony mají dva typy pórů: a) velké póry (makropóry) zajišťují rychlý konvektivní tok mobilní fáze monolitem a významně zrychlují přenos hmoty mezi mobilní a stacionární fází, b) středně velké póry (mesopóry) poskytují monolitu dostatečně veliký povrch, a tím vysokou separační kapacitu. Tato struktura umožňuje provozování monolitů při značně vysokých rychlostech mobilních fází bez přílišného zvýšení tlaku (McCalley 2002) a zároveň bez ztráty separační účinnosti, a to i pro separované makromolekuly (bílkoviny, syntetické polymery) (Švec 2009).
Monolitické kolony se připravují hydrolytickou polymerací tetramethoxysilanu nebo tetraethoxysilanu ve vodném roztoku kyseliny octové v přítomnosti polyethylenglykolu. Technologie výroby umožňuje přípravu monolitů s přesně definovanou strukturou, kdy vznikají výhradně mesopóry a makropóry vhodných a nastavitelných rozměrů. Monolitickou stacionární fázi na bázi silikagelu připravil, popsal a aplikoval např. profesor Tanaka se spoluautory (Minakuchi et al. 1996). Řada těchto kolon je již komerčně dostupných, např. Chromolith (Merck) nebo Onyx™ (Phenomenex v licenci Merck).
Z reálných aplikací a porovnávacích studií monolitických a konvenčních reverzních kolon vyplývá, že si také tyto kolony našly své uplatnění při rychlé chromatografii a u řady uživatelů nacházejí stále větší oblibu (Samanidou et al. 2004, Nováková et al. 2004). Také v analýze potravin se tato technologie začíná uplatňovat, autoři (Tzanavaras et Themelis 2007) uveřejnili metodiku simultánního stanovení kofeinu, theobrominu a theofyllinu v kávě a nealkoholických nápojích. Doba analýzy nepřesáhla 1 min, retenční čas posledně eluujícího kofeinu byl 0,7 min.
<h3>5 ZÁVĚR</h3>
O tom, že se UHPLC stala v posledním desetiletí oblíbenou a rozšířenou separační technikou, svědčí ohromné množství vydaných publikací. Z těchto prací vyplývá, že UHPLC se využívá jak k separaci malých organických molekul, tak i velkých molekul jako jsou proteiny a peptidy. Publikované výsledky potvrzují avizované výhody UHPLC jako jsou její rychlost, citlivost a dobré rozlišení. Své uplatnění nachází UHPLC také v analýze potravin a začíná též pronikat do oblasti pivovarství a sladovnictví.

Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 1. Teoretický úvod

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

PFAS

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Vědecký recenzovaný online časopis Kvasný průmysl (eISSN 2570-8619), vychází jako samostatné periodikum v angličtině. Od ročníku 2015 je obsah indexovaný databází Web of Science (edice ESCI), dále je indexován v databázích CAS, CAB Abstracts, DOAJ.
Časopis je publikovaný v režimu otevřeného přístupu Platinum Open Access s licencí Creative Commons. 

Kvasný průmysl

19th Czech - Slovak Spectroscopic Conference (CSSC) & Mössbauer Spectroscopy in Material Science (MSMS)

Hazmat Protect 2026

Waters Softwarové školení Empower Basic

Increasing LC/MS Productivity: Deciding Which High Throughput Solution is Right for You

AI-Assisted Analysis of Viscoelasticity with AFM

Powering Discovery at Scale