Organická analýza - Elektroseparační metody

<h5><strong>8.2 Afinitní kapilární elektroforéza</strong></h5>
<ul>
<li>8.2.1 Úvod</li>
<li>8.2.2 Princip ACE</li>
<li>8.2.3 Vyhodnocení naměřených dat – Scatchardův graf</li>
<li>8.2.4 Techniky ACE<ul>
<li>8.2.4.1 Analýza rovnovážných směsí</li>
<li>8.2.4.2 Analýza založená na změně elektroforetických mobilit</li>
<li>8.2.4.3 ACE s imobilizovaným ligandem</li>
</ul>
</li>
<li>8.2.5 Aplikace ACE</li>
<li>8.2.6 Závěr</li>
</ul>
<blockquote>
<p><strong>Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.</strong></p>
</blockquote>
<blockquote>
<p>💡 <strong>Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.</strong></p>
</blockquote>
<h3><strong>Afinitní kapilární elektroforéza</strong></h3>
<h4><strong>Úvod</strong></h4>
<p><strong>Afinitní kapilární elektroforéza</strong> (<strong>ACE</strong>) zahrnuje kapilárně elektroforetické metody dělení látek, u kterých se v určité míře uplatňují selektivní, popřípadě i neselektivní interakce, například interakce léčiv (ligandů) s proteiny (receptory) nebo jinými makromolekulárními látkami [1]. Tyto interakce se mohou uplatňovat jak mimo separační kapiláru (např. po smíchání látek tvořících komplex v reakční viálce), tak přímo během separace v separační kapiláře. Nezbytným předpokladem je účinné oddělení volných a vázaných forem interagujících látek, čehož je dosaženo díky vysoké účinnosti a vysoké rozlišovací schopnosti kapilární elektroforézy. Výhodou ACE oproti klasické gelové elektroforéze je to, že se většinou používá separační elektrolyt (BGE), který nezpůsobuje denaturaci molekul a jeho složení se blíží fyziologickým roztokům. Nedochází tak k významnému ovlivnění přirozených rovnováh v systému [2]. ACE lze využít především pro kvantifikaci a identifikaci vazeb mezi studovanými molekulami (například interakce léčiv s proteiny, antigenů s protilátkami atd.), výpočet vazebných konstant a vazebných energií, měření enzymatických aktivit, charakterizaci efektivního náboje proteinů atd.</p>
<h4><strong>Princip ACE</strong></h4>
<p>Kapilární elektroforéza (CE) využívá dělení látek v elektrickém poli na základě jejich rozdílné velikosti a náboje [3]. V případě, kdy jsou v roztoku přítomny látky R a L (například protein a léčivo), mající rozdílné elektroforetické mobility a tvořící spolu komplex R-L, dochází v průběhu separace k ovlivnění migračních časů jednotlivých látek. Vhodnou volbou separačního systému a podmínek ACE je možné měřit jejich vzájemnou interakci právě na základě změn migračních časů. Příklad interakce receptor-ligand je schematicky znázorněn na Obr. níže.  V nepřítomnosti ligandu, L, migruje zóna molekul receptoru, R (např. protein) v separační kapiláře určitou rychlostí (µR) a její migrační čas odpovídá času tR. V přítomnosti ligandu, který s molekulou receptoru interaguje, dochází k ovlivnění migrační rychlosti zóny analytu a jejímu zpomalování, v závislosti na koncentračním poměru R a L. V případě vysycení koncentračních poměrů a vytvoření komplexu R-L budou migrační rychlost a migrační čas odpovídat μR-Lmax a tR-Lmax.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Vliv_interakce_receptor_ligand_na_migracni_cas_receptoru_a_vznikleho_komplexu_67f2a0211e/2-THETA-Obr.-Vliv-interakce-receptor-ligand-na-migracni-cas-receptoru-a-vznikleho-komplexu.jpg" alt="2 THETA: Obr. Vliv interakce receptor-ligand na migrační čas receptoru a vzniklého komplexu"/></p>
<h4><strong>Techniky ACE</strong></h4>
<p>Z praktického hlediska rozlišujeme tři uspořádání, ve kterých je možné ACE provádět [7]. Pokud dochází k interakci v kapalné fázi, jedná se o ACE v homogenním roztoku. Pokud je jedna z interagujích složek imobilizována na stěnách kapiláry, případně na nosiči, jedná se o ACE s imobilizovaným ligandem. Obr 8.20 Rozdělení technik ACE. Techniky ACE prováděné v homogenním roztoku jsou poměrně rozšířené, vzhledem k jejich jednoduchosti, malé spotřebě vzorků (analytů) a jednoduchém vyhodnocení. Jsou použitelné za předpokladu, že dochází k dostatečné separaci volných složek od vznikajících komplexů. V závislosti na stabilitě vzniklého komplexu lze použít buď Analýzu rovnovážných směsí nebo Analýzu založenou na změně elektroforetických mobilit. Na druhou stranu, techniky ACE využívající imobilizace ligandu nebo receptoru na stěny kapiláry nebo na pevném nosiči (kapilární gelová afinitní elektroforéza, kapilární afinitní elektrochromatografie) jsou používány méně často, protože kromě některých výhod (maximální účinnost interakcí) mají také některé nevýhody jako obtížná detekce nízkých koncentrací ligandů, možnosti změny procesu interakce v důsledku imobilizace a obtížná regenerace povrchu s navázaným ligandem.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Rozdeleni_technik_ACE_99f69f0feb/2-THETA-Obr.-Rozdeleni-technik-ACE.jpg" alt="2 THETA: Obr. Rozdělení technik ACE"/></p>
<h5><strong>ANALÝZA ROVNOVÁŽNÝCH SMĚSÍ</strong></h5>
<p>Toto uspořádání je vhodné pro systémy s pomalou kinetikou (obvykle stabilní interakce s vysokou afinitou receptor-ligand), u kterých lze jak vzniklý komplex, tak jednotlivé formy interagujícíh látek detekovat pomocí standardních detekčních metod (UV-VIS, LIF). Nutnou podmínkou je dostatečná separace jednotlivých složek směsi (ligand, receptor, komplex) a stabilita vzniklého komplexu. Při splnění podmínky tvorby stabilního komplexu se reakce provádí mimo separační kapiláru a CE slouží pouze k oddělení složek směsi. V praxi se postupuje tak, že jsou receptor a ligand nejprve smíchány v reakční viálce. Postupně se připraví několik směsí s různými koncentracemi látek a všechny tyto směsi se postupně analyzují pomocí CE. </p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Schema_postupu_analyzy_rovnovaznych_smesi_d793febf2c/2-THETA-Obr.-Schema-postupu-analyzy-rovnovaznych-smesi.jpg" alt="2 THETA Obr. Schéma postupu analýzy rovnovážných směsí.  Receptor a ligand jsou smíchány mimo separační kapiláru, vzniklý komplex s nezreagovanými analyty je nadávkován na separační kapiláru a složky směsi analyzovány."/></p>
<p>Separační kapilára je naplněna separačním elektrolytem (BGE) bez přídavku receptoru nebo ligandu. Během analýzy dochází k elektromigračnímu oddělení zón receptoru, ligandu a vzniklého komplexu, které jsou detekovány ve formě píků. Plocha píků odpovídá koncentraci jednotlivých složek (je nutno předem provést kalibraci). Pokud je komplex dostatečně stabilní a CE analýza rychlá, nedochází v průběhu separace ke znatelnému rozpadu komplexu. I když k takovému rozpadu komplexu během CE analýzy dojde, koncentrace původních látek (ligand, receptor) se během analýzy nemění, protože jsou od komplexu separovány. </p>
<h5><strong>Kontinuální frontální analýza</strong></h5>
<p>Kontinuální frontální analýza [8] představuje variantu předchozí techniky analýzy rovnovážných směsí. Separační kapilára je také v tomto případě naplněna BGE bez přídavku receptoru a ligandu. Metodu lze použít pouze u reakcí s pomalou kinetikou a je opět potřeba splnit podmínku, že disociace vzniklého komplexu musí být pomalejší než doba analýzy.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Schema_provedeni_kontinualni_frontalni_analyzy_zaznam_z_detektoru_f729b4fbfd/2-THETA-Obr.-Schema-provedeni-kontinualni-frontalni-analyzy-zaznam-z-detektoru.jpg" alt="2 THETA: Obr. Schéma provedení kontinuální frontální analýzy, záznam z detektoru"/></p>
<h5><strong>Metoda částečného plnění</strong></h5>
<p>V tomto uspořádání je kapilára opět naplněna separačním elektrolytem a postupně se nadávkuje malý objem roztoku obsahujícího ligand a roztoku obsahující receptor a dva markery. Oba nadávkované vzorky jsou od sebe odděleny separačním elektrolytem. Markery slouží pro korekci migračního času receptoru, který může být ovlivněn například změnou EOF apod.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Metoda_castecneho_plneni_50fc9d1000/2-THETA-Obr.-Metoda-castecneho-plneni.jpg" alt="2 THETA: Obr. Metoda částečného plnění"/></p>
<h5><strong>ANALÝZA ZALOŽENÁ NA ZMĚNĚ ELEKTROFORETICKÝCH MOBILIT</strong></h5>
<p> V tomto uspořádání je receptor (nebo ligand) přidán do separačního elektrolytu (BGE). Většinou se volí separační systém tak, aby větší molekula (např. receptor/protein) byla přidána do BGE a menší, interagující látka (ligand/léčivo) se nadávkuje do separační kapiláry. V důsledku interakce ligandu s receptorem přítomným v BGE dochází ke změně migračního času ligandu, a to právě v závislosti na koncentraci receptoru v BGE. Toto uspořádání je vhodné použít pro systémy, kdy je vytvořený komplex málo stabilní (afinita R-L je nízká), ale kinetika tvorby komplexu je rychlá.</p>
<h5><strong>Metoda Hummel-Dreyerova</strong></h5>
<p>Hummel-Dreyerova metoda v ACE (původně vyvinutá v roce 1962 pro analýzu gelovou chromatografií) spočívá v provedení série analýz, kdy je kapilára naplněna BGE s měnící se koncentrací nízkomolekulárního ligandu (L) a dávkuje se malé množství receptoru(R).</p>
<h5><strong>Vakantní metoda</strong></h5>
<p>Metoda vyvinutá v roce 1997 [11] spočívá v naplnění kapiláry BGE, receptorem a ligandem. Provede se série analýz se stálou koncentrací receptoru (R) a měnící se koncentrací ligandu (L). Přítomnost receptoru a ligandu způsobuje vysokou absorbanci BGE. Dávkuje se malé množství BGE neobsahující ani L ani R.</p>
<p><strong>ACE S IMOBILIZOVANÝM LIGANDEM</strong></p>
<p>V tomto uspořádání je ligand imobilizován na stěnu separační kapiláry nebo na nosič (částice, polymerní materiály). Molekuly receptoru přítomné v roztoku se při průchodu separační kapilárou navážou na imobilizovaný ligand. V závislosti na afinitě vůči imobilizovanému ligandu dochází ke zpomalování molekul receptoru, zatímco neinteragující látky migrují bez změny rychlosti. Porovnáním pohyblivosti jednotlivých látek v systému bez ligandu lze určit, které molekuly mají afinitu k použitému ligandu a ze stupně retardace a koncentrace imobilizovaného ligandu lze stanovit též disociační konstantu komplexu separovaná látka - ligand. Tato technika je ale v praxi méně používaná, z důvodu obtížné detekce nízkých koncentrací ligandů, možnosti změny procesu interakce v důsledku imobilizace a obtížné regenerace povrchu s navázaným ligandem. Využívá se však například pro specifický záchyt a obohacení vybraných látek (receptorů). </p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Obr_Technika_ACE_s_imobilizovanym_ligandem_c331933f4a/2-THETA-Obr.-Technika-ACE-s-imobilizovanym-ligandem.jpg" alt="2 THETA: Obr. Technika ACE s imobilizovaným ligandem"/></p>
<h4><strong>Aplikace ACE</strong></h4>
<p>ACE nachází využití především pro kvantifikaci a identifikaci vazeb mezi studovanými molekulami, dále k výpočtu vazebných energií, stanovení vazebných konstant, měření enzymatických aktivit, charakterizaci efektivního náboje protein atd. Hlavní uplatnění nachází ACE při studiu interakcí léčiv (léčivo-protein, léčivo glycoprotein, interakce antibiotik, DNA), studiu interakcí typu enzym—inhibitor, enzym-substrát, antigen-protilátka, hormon-receptor, lektin-sacharid, atd. Významné jsou studie například z hlediska farmakologického, protože umožňují sledovat například účinnost nasazené léčby, monitorovat koncentraci aktivní formy léčiva (volné, vázané) v biologických tekutinách a studium selektivních biologických procesů. Využití ACE bylo shrnuto v několika nedávných přehledných článcích [7, 12, 13]. Vybrané příklady studovaných interakcí jsou shrnuty v Tabulce níže. </p>
<h5>Tabulka: Příklady studovaných interakcí</h5>
<ul>
<li><strong>Studovaná interakce</strong> / <strong>Technika</strong></li>
<li><strong>Interakce HSA s léčivy (warfarin, antihistaminy, Hg, chloroquine, atd.)</strong> / <strong>ACE, FACE</strong></li>
<li><strong>Interakce BSA s léčivy</strong> / <strong>ACE</strong> </li>
<li><strong>Interakce proteinů s heparinem</strong> / <strong>ACE</strong> </li>
<li><strong>Interakce protilátka-antigen</strong> / <strong>ACE</strong> </li>
<li><strong>Interakce proteinů s malými molekulami</strong> / <strong>ACE, PFACE</strong></li>
<li><strong>Interakce proteinů s kovy</strong> / <strong>ACE</strong>  </li>
<li><strong>Interakce polymer-polymer</strong> / <strong>ACE</strong> </li>
<li><strong>Interakce DNA-polymer</strong> / <strong>ACE</strong> </li>
<li><strong>Interakce cyklodextrinů s malými molekulami</strong> / <strong>ACE</strong></li>
</ul>
<h3><strong>Závěr</strong></h3>
<p>ACE je vysoce účinná separační metoda vhodná ke studiu interakcí, především ke stanovení disociačních a vazebných konstant a stechiometrie reakcí. Její výhodou je vysoké rozlišení, krátká doba analýzy (vhodné pro méně stabilní rovnováhy) a malá spotřeba vzorku spojená s nízkými náklady na celkovou analýzu. Výhodou je také možnost simultánního stanovení více látek v jedné analýze a studium jejich interakce se stejným ligandem. ACE je vhodnou komplementární technikou k afinitní HPLC a dalším technikám (ELISA, radioimunologické metody, NMR, gelová elektroforéza atd.), které se používají ke studiu interakcí látek. Lze očekávat, že s rozvojem kapilárně elektroforetických metod si ACE zachová statut významné techniky vhodné k určování struktury a interakcí biologicky aktivních látek. Vývoj nových technologií (mikročipová elektroforéza, vtištěné polymery, monolytické nosiče) a vývoj citlivých detekčních metod bude mít pro využití aplikačního potenciálu ACE v budoucnosti velký význam.</p>


Organická analýza - Elektroseparační metody (ACE)

Analýza anorganických látek - Termoanalytické metody

Analýza anorganických látek - Průtokové metody  

<h3><strong>6 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE</strong></h3>
<h5><strong>6.1 Teoretické základy</strong></h5>
<h5><strong>6.2 Konstrukce hmotnostního spektrometru</strong></h5>
<ul>
<li>6.2.1 Ionizační techniky<ul>
<li>6.2.1.1 Elektronová ionizace (EI)</li>
<li>6.2.1.2 Chemická ionizace (CI)</li>
<li>6.2.1.3 Elektrosprej</li>
<li>6.2.1.4 Chemická ionizace za atmosférického tlaku</li>
<li>6.2.1.5 Fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI)</li>
<li>6.2.1.6 MALDI</li>
<li>6.2.1.7 Indukčně vázané plazma (ICP)</li>
<li>6.2.1.8 Iontové zdroje pro přímou analýzu vzorku</li>
</ul>
</li>
</ul>
<blockquote>
<p><strong>Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.</strong></p>
</blockquote>
<blockquote>
<p>💡 <strong>Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.</strong></p>
</blockquote>
<h3><strong>Teoretické základy</strong></h3>
<p><strong>Hmotnostní spektrometrie</strong> je analytická metoda založená na interakci iontů s elektrickým, případně magnetickým polem. Pojmem „pole“ (případně „fyzikální pole“) se rozumí oblast v prostoru, která silově působí na specie schopné s tímto polem interagovat. </p>
<p><strong>Elektrické pole</strong> je vytvářeno elektricky nabitým tělesem. Podle závislosti na čase lze definovat nestacionární (časově proměnné) a stacionární (časově neměnné) elektrické pole. Tvar elektrického pole (a tedy i směr působení síly) je popisován siločárami, které vycházejí z kladné elektrody a vstupují do záporné, přičemž tečny v jednotlivých bodech ukazují směr působení elektrického pole. Dvěma základními tvary jsou homogenní (siločáry probíhají rovnoběžně) a radiální elektrické pole (siločáry vycházejí z jednoho bodu nebo do něj vstupují). V hmotnostní spektrometrii se využívá homogenní elektrostatické pole, které je vytvářeno vkládáním stejnosměrného napětí na dvě deskové elektrody, které mohou být rovinné nebo zakřivené. V tomto případě bývá elektrostatické pole stacionární. Nestacionární elektrické pole se využívá v analyzátorech s tyčovými nebo prstencovými elektrodami.</p>
<p><strong>Magnetické pole</strong> je vyvoláno pohybujícím se elektrickým nábojem (tedy elektrickým proudem), lze jej tedy pozorovat okolo elektrických vodičů. Orientaci siločar magnetického pole v okolí přímého vodiče určuje Ampérovo pravidlo pravé ruky: položíme-li ruku na vodič tak, že palec ukazuje směr protékajícího proudu (od kladného pólu k zápornému), pak zahnuté prsty ukazují orientaci siločar magnetického pole. U permanentních magnetů je magnetické pole vytvářeno tzv. vázanými elektrickými proudy. V hmotnostní spektrometrii je magnetické pole generováno pomocí elektromagnetů tvořených cívkou. Pro zesílení je do cívky vkládáno jádro z magneticky měkkého materiálu (magnetický efekt vykazuje pouze při průchodu proudu).</p>
<h3><strong>Konstrukce hmotnostního spektrometru</strong></h3>
<p>Základní části hmotnostního spektrometru jsou:</p>
<ul>
<li>(i) iontový zdroj, sloužící k převedení neutrálních molekul na ionty;</li>
<li>(ii) analyzátor, sloužící k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle poměru hmotnosti a náboje (m/z);</li>
<li>(iii) detektor převádějící intenzitu jednotlivých fragmentů na elektrický signál;</li>
<li>(iv) vakuový systém, udržující ve spektrometru požadovanou úroveň vakua, podle typu analyzátoru 10¯³ až 10¯¹¹ Pa; </li>
<li>(v) systém pro řízení hmotnostního spektrometru a pro sběr a zpracování naměřených dat.</li>
</ul>
<h4><strong>Ionizační techniky</strong></h4>
<p>Základním předpokladem úspěchu hmotnostně spektrometrického experimentů je úspěšná ionizace vzorku. První ionizační technikou v hmotnostní spektrometrii, dnes už nevyužívanou, byl elektrický výboj v plynech [1]. Během vývoje byla ionizačním technikám věnována značná pozornost a postupně byla navržena řada různých uspořádání, z nichž pouze malá část se v současnosti využívá. Ty budou v následujícím textu podrobněji popsány.<br/>V organické hmotnostní spektrometrii lze ionizovat vzorky ve všech třech skupenstvích. Pro plynné vzorky se nejčastěji využívá elektronová ionizace (<strong>EI, Electron Ionization</strong>), případně ionizace chemická (<strong>CI, <a href="https://gcms.cz/library?instrumentationItems=3&amp;search=Chemical+Ionization">Chemical Ionization</a></strong>). Pro vzorky kapalné jsou využívány tzv. sprejovací techniky za atmosférického stavu: elektrosprej (<strong>ESI, <a href="https://gcms.cz/library?instrumentationItems=3&amp;search=Electron+Ionization">Electrospray Ionization</a></strong>), chemická ionizace za atmosférického tlaku (<strong>APCI, <a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=31&amp;search=Atmospheric+Pressure+Chemical+Ionization">Atmospheric Pressure Chemical Ionization</a></strong>) a fotoionizace za atmosférického tlaku (<strong>APPI, <a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=31&amp;search=Atmospheric+Pressure+Photoionization">Atmospheric Pressure Photoionization</a></strong>). Pro vzorky pevné je nejdůležitější ionizační technikou MALDI (<strong><a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=25">Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization</a></strong>). Pro prvkovou analýzu organických i organokovových sloučenin je pak využívána <a href="https://icpms.cz/library?instrumentationItems=83"><strong>ionizace pomocí indukčně vázaného plazmatu</strong></a> (<strong>ICP</strong>).</p>
<h5><strong>ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI)</strong></h5>
<p>Tato technika je podle starší terminologie označována jako „ionizace nárazem elektronu“ (<strong>Electron Impact Ionization</strong>). Poprvé ji popsal H. D. Smyth roku 1922 jako metodu pro určování ionizačních potenciálů látek [2], ale záhy ji použil pro ionizaci plynných prvků – např. dusíku [3], vodíku [4], oxidu uhličitého [5] a řady dalších. Principem je interakce elektronů urychlených na kinetickou energii 70 eV s neutrálními molekulami, při které dochází k vyražení elektronu z elektronového obalu molekuly za vzniku radikálkationtu, označovaného též jako molekulový ion:</p>
<p>M + 𝑒⁻ → M⁻▪ + 2 𝑒⁻</p>
<p>Nadbytek energie předaný při interakci (ionizační energie organických sloučenin se nejčastěji pohybuje v rozmezí 8–14 eV) pak vede k fragmentaci molekulového iontu za vzniku nabitých fragmentů F (nejčastěji se sudým počtem elektronů) a neutrálních ztrát N (nejčastěji ve formě radikálů):</p>
<p>M⁻▪ → F₁ + N₁▪ + F₂ + N₂▪ + ...</p>
<p>Vzhledem k velkému množství energie předávanému ionizované spécii při interakci s ionizujícím elektronem je elektronová ionizace označována jako tvrdá ionizační technika. Při EI jsou produkovány pouze kationty. </p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Schema_iontoveho_zdroje_pri_elektronove_ionizaci_3ddade67dc/2-THETA-Schema-iontoveho-zdroje-pri-elektronove-ionizaci.jpg" alt="2 THETA: Schéma iontového zdroje při elektronové ionizaci. Vzorek je přiváděn kolmo k směru ionizujících elektronů (kolmo na plochu papíru)"/></p>
<p>Schéma iontového zdroje pro elektronovou ionizaci je uvedeno výše. Elektrony jsou emitovány ze žhaveného vlákna nazývaného filament (česky vlákno), a jsou přitahovány k protilehlé elektrodě označované jako trap (česky lapáček). Elektrické pole jim uděluje kinetickou energii 70 eV (1 eV = 1,602.10¯¹⁹J). Permanentní magnet přispívá k prodloužení dráhy letu ionizujících elektronů tím, že z přímé trajektorie vytváří šroubovici, a tím zvyšuje pravděpodobnost jejich interakce s neutrální molekulou. Elektroda označovaná jako repeler (vytěsňovací elektroda) pak slouží k vypuzení vzniklých iontů směrem k analyzátoru. V iontovém zdroji je udržováno vakuum na úrovni 10¯³ Pa, čímž se zabrání kolizím vzniklých iontů, ať již mezi sebou nebo s neutrálními molekulami.</p>
<p>Fragmentace při energii ionizujících elektronů 70 eV je reprodukovatelná. Díky tomu má elektronová ionizace jedinečnou výhodu, kterou je možnost vytváření rozsáhlých knihoven hmotnostních spekter (obsahujících dnes přes půl milionu záznamů). Neznámou sloučeninu lze pak identifikovat porovnáním experimentálního spektra s knihovnou. Další výhodou je velmi dobrá znalost fragmentačních mechanismů jednotlivých tříd sloučenin [6], umožňující vyřešení struktury analyzované sloučeniny v případě selhání identifikace pomocí knihovny. Nevýhodou elektronové ionizace je omezená použitelnost pouze pro těkavé a termostabilní sloučeniny, a v některých případech i malá intenzita nebo úplná absence molekulárního iontu nesoucího informaci o molekulové hmotnosti analyzované sloučeniny. </p>
<h5><strong>CHEMICKÁ IONIZACE (CI)</strong></h5>
<p>Chemická ionizace byla poprvé popsána roku 1966 Munsonem a Fieldem [7], jevy související s touto technikou byly však pozorovány podstatně dříve. Již roku 1916 pozoroval Dempster v hmotnostním spektru vodíku pík s m/z = 3, který vysvětlil jako H⁺₃ [8]. Roku 1952 sovětský vědec Viktor Lvovič Talrose pozoroval ve spektru methanu neobvykle intenzivní ion s m/z = 17 a objasnil jeho vznik ion-molekulární reakcí radikálkationtu a neutrální molekuly methanu [9]:</p>
<p>CH₄⁺▪ + CH₄   → CH₅⁺ + CH₃▪</p>
<p>Výše uvedené jevy byly způsobeny nedostatečně kvalitním vakuem v iontovém zdroji, kdy docházelo ke kolizím vzniklých iontů s neutrálními molekulami. Tento princip byl pak využit při chemické ionizaci, kdy v prvním kroku je elektronovou ionizací ionizován reakční plyn (např. methan, isobutan, amoniak), kterého je v iontovém zdroji výrazně více než analyzované látky (v poměru cca 10⁴:1). Tlak v iontovém zdroji je v důsledku nátoku reakčního plynu podstatně vyšší než při elektronové ionizaci (obvykle v rozmezí 10–100 Pa), takže ion-molekulárními reakcemi dochází ke vzniku reaktivních spécií.</p>
<h5><strong>ELEKTROSPREJ</strong></h5>
<p>Elektrosprej je hodnocen jako jedna z nejvýznamnějších ionizačních technik posledního období. V podstatě se nejedná o ionizační techniku v pravém slova smyslu, ale o metodu převodu iontů z kapalné do plynné fáze. Tato technika byla ve funkci hmotnostně spektrometrického iontového zdroje poprvé využita roku 1968, kdy Malcolm Dole takto úspěšně analyzoval polystyren s molekulovou hmotností přesahující 50 kDa [10]. Pro analýzu organických látek byl elektrosprej poprvé využit roku 1984 [11], rok poté byla tato technika využita pro sekvenování peptidů [12]. Významným mezníkem ve využití elektrospreje bylo objevení jeho schopnosti mnohonásobně nabíjet biopolymery (peptidy, proteiny a další), což umožnilo analyzovat makromolekuly na přístrojích se standardním hmotnostním rozsahem [13]. Za tento objev obdržel jeho autor John B. Fenn roku 2002 Nobelovu cenu za chemii.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Schema_elektrospreje_502f60c8c0/2-THETA-Schema-elektrospreje.jpg" alt="2 THETA: Schéma elektrospreje"/></p>
<p>Schéma klasického elektrospreje je uvedeno na výše. Vzorek je přiváděn do sprejovací kapiláry (zpravidla nerezové), na kterou je vkládáno vysoké napětí (typicky 4 kV); protielektrodou je vstup do hmotnostního spektrometru. Působením elektrostatických sil dojde k vytvoření tzv. Taylorova kužele, z jehož vrcholku jsou sprejovány mnohonásobně nabité kapénky roztoku vzorku. Odpařováním rozpouštědla v důsledku zvýšené teploty ve sprejovacím prostoru (zpravidla je využíván sušící plyn s teplotou nad 300 °C) dochází ke zmenšování kapének, což vede ke zvyšování odpudivých sil mezi souhlasně nabitými molekulami vzorku. Proti těmto silám působí povrchové napětí kapaliny, které se snaží udržet kapénku vcelku. Mez, kdy se tyto síly vyrovnají, je označována jako Rayleighův limit. Po jeho překročení dochází k tzv. Coulombické explozi, kdy se kapénka rozpadne na řadu menších, a proces se opakuje až do uvolnění individuálních iontů</p>
<p>Sprejování pomocí elektrostatického pole se využívá v nanoelektrospreji, kde jsou velmi nízké průtoky (jednotky až stovky nL/min). Při spojení s kapalinovou chromatografií, kde průtok mobilní fáze je podstatně vyšší, je zapotřebí použít podpůrného sprejovacího mechanismu, kterým je dnes nejčastěji pneumatické zmlžování, kdy zmlžovací plyn (nejčastěji dusík) se přivádí kapilárou soustředně umístěnou vně kapiláry sprejovací. Někdy se pro pneumaticky podporovaný elektrosprej používá označení „ionspray“,</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Pneumaticky_podporovany_elektrosprej_Ionspray_bocni_prurez_a6ab66786e/2-THETA-Pneumaticky-podporovany-elektrosprej-(Ionspray)-bocni-prurez.jpg" alt="2 THETA: Pneumaticky podporovaný elektrosprej (Ionspray) – boční průřez"/></p>
<h5><strong>CHEMICKÁ IONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU</strong></h5>
<p>Tuto ionizační techniku poprvé použil E.C. Horning v roce 1974 [15]. Schéma tohoto iontového zdroje je uvedeno na níže. Vzorek je pneumaticky zmlžován do vyhřívané odpařovací komůrky, páry rozpouštědla a analyzovaných látek jsou vedeny do prostoru koronového výboje vytvářeného napětím vkládaným mezi koronovou jehlu a vstupní kapiláru. Zde dochází k ionizaci par rozpouštědla (které jsou ve velkém přebytku), a vzniklé reaktivní produkty pak ion-molekulárními reakcemi ionizují molekuly analyzovaných látek.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Chemicka_ionizace_za_atmosferickeho_tlaku_APCI_ad403156a1/2-THETA-Chemicka-ionizace-za-atmosferickeho-tlaku-(APCI).jpg" alt="2 THETA: Chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI)"/></p>
<h5><strong>FOTOIONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU (APPI)</strong></h5>
<p>Tato technika byla poprvé popsán roku 2000 [16]. Konstrukčně je tento iontový zdroj prakticky shodný s APCI, pouze namísto koronové jehly je zde umístěn zdroj UV-záření, jehož fotony poskytují energii pro ionizaci.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Fotoionizace_za_atmosferickeho_tlaku_APPI_218a4ea59b/2-THETA-Fotoionizace-za-atmosferickeho-tlaku-(APPI).jpg" alt="2 THETA: Fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI)"/></p>
<h5><strong>MALDI</strong></h5>
<p>Technika MALDI (<strong>Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization</strong>, desorpce/ionizace laserem za účasti matrice) ionizuje z pevného stavu. Je vhodná pro ionizaci makromolekul – biopolymerů i syntetických polymerů s molekulovou hmotností přesahující 1 MDa. Tato technika byla poprvé publikována v roce 1988; Koichi Tanaka se spolupracovníky využili kapalné matrice – glycerínu s ultrajemným práškovým kobaltem [17], zatímco Karas s Hillenkampem použili jako matrice pevnou látku – kyselinu nikotinovou [18]. Tanaka byl za objev MALDI oceněn jednou čtvrtinou Nobelovy ceny za chemii v roce 2002.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Schema_iontoveho_zdroje_MALDI_a405873198/2-THETA-Schema-iontoveho-zdroje-MALDI.jpg" alt="2 THETA: Schéma iontového zdroje MALDI"/></p>
<p>Technika MALDI má celou řadu modifikací:</p>
<ul>
<li><strong>LDI</strong> (<strong>Laser Desorption/Ionization</strong>) je technika ionizace laserovým pulsem bez přítomnosti matrice, která je použitelná pro molekuly schopné absorbovat v UV oblasti (např. polycyklické aromatické uhlovodíky).</li>
<li><strong>SELDI</strong> (<strong>Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization</strong>) využívá terčíků s chemicky modifikovaným povrchem, na který jsou specifickými interakcemi vázány sledované sloučeniny. Po nanesení vzorku a jeho vysušení se terčík opláchne, čímž se odstraní nežádoucí příměsi, a po nanesení matrice následuje analýza [19].</li>
<li><strong>SALDI</strong> (<strong>Surface-Assisted Laser Desorption/Ionization</strong>) využívá desorpce peptidů a proteinů laserem z grafitového povrchu [20].</li>
<li><strong>NALDI</strong> (<strong>Nanostructure-Assisted Laser Desorption/Ionization</strong>) využívá k podpoře desorpce a ionizace pomocí laseru nanočástic [21].</li>
<li><strong>SPALDI</strong> (<strong>Silicon Nanoparticle Assisted Laser Desorption/Ionization</strong>) je variantou předchozí techniky, která využívá křemíkových nanočástic [22].</li>
<li><strong>DIOS</strong> (<strong>Desorption-Ionization on Porous Silicon</strong>) je založena na využití terčíků pokrytých porézním křemíkem [23].</li>
</ul>
<h5><strong>INDUKČNĚ VÁZANÉ PLAZMA (ICP)</strong></h5>
<p>Pro prvkovou analýzu zejména organokovových sloučenin je jako iontový zdroj využíváno indukčně vázané plazma. Vzorek ve formě aerosolu se vnáší do plazmové hlavice, ve které je ve vysokofrekvenčním elektromagnetickém poli udržováno argonové plazma o teplotě 6 000 – 10 000 K. Do analytického kanálu plazmatu je vnášen aerosol vzorku, který je vysušen a účinně atomizován. Uvolněné atomy jsou excitovány a ionizovány; díky vlastnostem ICP dochází přednostně k ionizaci do prvního stupně.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Indukcne_vazane_plasma_3d0e1c04d7/2-THETA-Indukcne-vazane-plasma.jpg" alt="2 THETA: Indukčně vázané plasma"/></p>
<h5><strong>IONTOVÉ ZDROJE PRO PŘÍMOU ANALÝZU VZORKU</strong></h5>
<ul>
<li><p><strong>DART</strong> (<strong>Direct Analysis in Real Time</strong>) pracuje za atmosférického tlaku. K ionizaci využívá elektronicky nebo vibronicky excitované atomy helia, které jsou generovány (spolu s ionty) pomocí doutnavého výboje mezi jehlovou elektrodou a protilehlou diskovou elektrodou</p>
</li>
<li><p><strong>Desorpční elektrosprej</strong> (<strong>Desorption electrospray, DESI</strong>) [25] využívá obdobně jako MALDI destičku s terčíky, na nichž jsou naneseny vzorky.</p>
</li>
<li><p><strong>Desorpční fotoionizace za atmosférického tlaku</strong> (<strong>Desorption Atmospheric Pressure Photoionization, DAPPI</strong>) [27] je ionizační technika, při které je vzorek „ofukován“ horkými parami rozpouštědla a zároveň ozařován UV zářením.</p>
</li>
<li><p><strong>Měkká ionizace chemickou reakcí při přenosu</strong> (<strong>Soft Ionization by Chemical Reaction in Transfer, SICRIT</strong>) [28] je pravděpodobně nejnovější ambientní ionizační technikou. Vzorek je ionizován v kapiláře umístěné přímo před vstup do hmotnostního spektrometru působením dielektrického bariérového výboje generujícího studené plazma.</p>
</li>
</ul>


Organická analýza - Hmotnostní spektrometrie (základy, konstrukce MS)

Analýza anorganických látek - Optická emisní spektrometrie (OES)

<h3><strong>6 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE</strong></h3>
<h5><strong>6.2 Konstrukce hmotnostního spektrometru</strong></h5>
<ul>
<li><p>6.2.2 Analyzátory</p>
<ul>
<li>6.2.2.1 Magnetický analyzátor (B)</li>
<li>6.2.2.2 Elektrostatický analyzátor (ESA, E)</li>
<li>6.2.2.3 Spektrometry s dvojitou fokusací</li>
<li>6.2.2.4 Kvadrupól (Q)</li>
<li>6.2.2.5 Sférická iontová past (3D-IT)</li>
<li>6.2.2.6 Lineární iontová past (LIT)</li>
<li>6.2.2.7 Průletový analyzátor (TIME-OF-FLIGHT, TOF)</li>
<li>6.2.2.8 Iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT-ICR)</li>
<li>6.2.2.9 Orbitrap</li>
</ul>
</li>
<li><p>6.2.3 Detektory</p>
</li>
<li><p>6.2.4 Vakuový systém</p>
<ul>
<li>6.2.4.1 Mechanické vývěvy</li>
</ul>
</li>
</ul>
<blockquote>
<p><strong>Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.</strong></p>
</blockquote>
<blockquote>
<p>💡 <strong>Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.</strong></p>
</blockquote>
<h4><strong>Analyzátory</strong></h4>
<p>Pro rozdělení jednotlivých iontů podle jejich poměru hmotnosti a náboje <em>m/z</em> (označovaného též jako efektivní hmotnost) slouží analyzátory, které využívají čtyř základních fyzikálních principů:</p>
<ol>
<li><p>odchýlení trajektorie v magnetickém a elektrickém poli (sektorové analyzátory)</p>
</li>
<li><p>oscilace v elektrickém poli vytvářeném kombinací stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí (kvadrupól, sférická iontová past, lineární iontová past)</p>
</li>
<li><p>měření doby letu (analyzátor doby letu)</p>
</li>
<li><p>absorpce energie při cykloidálním pohybu v elektrickém (orbitrap) nebo magnetickém poli (iontová cyklotronová rezonance)</p>
</li>
</ol>
<p>Důležitou charakteristikou analyzátorů je <strong>rozlišení</strong> (<strong>resolution</strong>), které je definováno buď pomocí dvou píků hmotností <em>m₁</em> a <em>m₂</em> stejné výšky nacházejících se ve spektru vedle sebe s překryvem ve výši 10 %, nebo na základě jednoho píku pomocí jeho hmotnosti <em>m</em> a šířky píku <em>∆m</em>, nejčastěji v polovině výšky (FWHM – Full Width at Half of Maximum). Pro gaussovské píky platí, že 𝑅𝐹𝑊𝐻𝑀⁄𝑅 = 1,8.</p>
<h5><strong>MAGNETICKÝ ANALYZÁTOR (B)</strong></h5>
<p>Magnetický analyzátor je tvořen výsečí homogenního magnetického pole generovaného elektromagnetem, které mění trajektorii iontů o určitý úhel. Ionty o hmotnosti m s nábojem z jsou před vstupem do analyzátoru urychleny elektrickým polem s napětím V.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Magneticky_sektor_dcc1114b74/2-THETA-Magneticky-sektor.jpg" alt="2 THETA: Magnetický sektor"/></p>
<h5><strong>ELEKTROSTATICKÝ ANALYZÁTOR (ESA, E)</strong></h5>
<p>Elektrostatický analyzátor je tvořen dvěma sférickými deskovými elektrodami připojenými ke zdroji vysokého napětí V.</p>
<h5><strong>ANALYZÁTORY S DVOJITOU FOKUSACÍ</strong></h5>
<p>Většina iontových zdrojů generuje ionty s jistým rozptylem kinetických energií, takže pomocí magnetického analyzátoru nelze získat hmotnostní spektrum s vyšším rozlišením. Tento problém řeší zařazení elektrostatického sektoru (E) před magnetický analyzátor (B). Ve spektrometrech je používáno několik<br/>geometrií typu EB:</p>
<ol>
<li>Geometrie Nier-Johnsonova používá 90° elektrostatický a 60° magnetický sektor, výstupní paprsek je stále zaostřen pro daný poloměr r. Geometrie je vhodná pro skenovací spektrometry.</li>
<li>Reverzní Nier-Johnsonova má magnetický sektor předřazený před elektrostatickým sektorem (geometrie BE).</li>
<li>Geometrie Mattauch-Herzogova používá 31,8° elektrostatický a 90° magnetický sektor. Výstupní paprsek je zaostřen do jedné fokální roviny pro všechny hmotnosti. Uspořádání je vhodné pro záznam spektra na fotografickou desku nebo pomocí multikanálového detektoru.</li>
<li>Geometrie podle Matsudy má 85° elektrostatický sektor následovaný 72,5° magnetickým sektorem. Pro speciální účely jsou využívány i vícesektorové analyzátory geometrie např. EBE, BEB, EBEB apod.</li>
</ol>
<h5><strong>KVADRUPÓL (Q)</strong></h5>
<p>Kvadrupólový hmotnostní analyzátor byl poprvé popsán roku 1953 [30]. Konstrukčně je poměrně jednoduchý – je tvořen čtyřmi paralelními tyčemi kruhového nebo hyperbolického průřezu. Dráha letu iontů je v tomto analyzátoru ovlivňována pouze v rovině kolmé na tyče, ve směru rovnoběžně s tyčemi ionty uchovávají kinetickou energii udělenou jim před vstupem do kvadrupólu. Vždy dvě protilehlé tyče jsou vodivě spojeny a je na ně vkládáno radiofrekvenční napětí V se superponovanou stejnosměrnou složkou U; poměr těchto dvou napětí se při skenu udržuje konstantní. Kvadrupól pracuje jako filtr, kterým mohou projít jen ionty o určitém poměru <em>m/z</em>, přičemž propouštěná hmotnost (resp. <em>m/z</em>) je lineárně závislá na elektrickém potenciálu elektrod. Jeho změnou je tak umožněno jednoduché a rychlé skenování přes zvolený rozsah <em>m/z</em>. Funkci kvadrupólu si lze představit tak, že ionty po vlétnutí mezi tyče začnou v důsledku elektrostatického přitahování a odpuzování opisovat šroubovice. Průměr této šroubovice se buď nezvyšuje – tyto ionty jsou na stabilní trajektorii, procházejí kvadrupólem a dopadají na detektor, nebo se zvyšuje, a tyto ionty pak dopadnou na tyče kvadrupólu nebo prolétnou prostorem mezi nimi.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Schema_kvadrupolu_7ae1002c23/2-THETA-Schema-kvadrupolu.jpg" alt="2 THETA: Schéma kvadrupólu.jpg"/></p>
<h5><strong>SFÉRICKÁ IONTOVÁ PAST (3D-IT)</strong></h5>
<p>Sférická iontová past (před objevem lineární iontové pasti označovaná pouze jako iontová past), někdy též kvadrupólová iontová past, byla navržena paralelně s kvadrupólem jako alternativní uspořádání elektrod [31]. Nicméně jako hmotnostně spektrometrický analyzátor začala být využívána až po objevu možnosti uvedení iontů na nestabilní trajektorie [32]. Kvadrupólová iontová past je tvořena třemi elektrodami s hyperbolickými povrchy; jedna je prstencová a dvě jsou krycí. Ty jsou opatřeny otvory pro vstup a výstup iontů. Vnitřní prostor iontové pasti uzavřený zmíněnými elektrodami je typicky poměrně malý – přes 1 ml. Na prstencovou elektrodu se vkládá základní radiofrekvenční napětí, které uvnitř pasti vytváří kvadrupolární elektrické pole. Na krycí elektrody je pak dle potřeby vkládáno pomocné radiofrekvenční napětí sloužící různým účelům. Do iontové pasti se kontinuálně přivádí malé množství helia, které slouží ke koliznímu chlazení po napuštění iontů nebo k jejich kolizní aktivaci v režimu tandemové hmotnostní spektrometrie.</p>
<p>Sférická iontová past se vyznačuje několika slabinami, které je zapotřebí mít na zřeteli při jejím využívání:</p>
<ul>
<li><p><strong>Náchylnost ke vzniku prostorového náboje</strong> je dána malým vnitřním objemem tohoto zařízení. </p>
</li>
<li><p><strong>Efektivita záchytu iontů při napouštění</strong> je dosti malá – pouze asi 5 % iontů vstupujících do iontové pasti je zachyceno na stabilních trajektoriích. </p>
</li>
<li><p><strong>Při skenování</strong> by ionty měly opustit prostor iontové pasti výstupním otvorem a dopadnout na konverzní dynodu.</p>
</li>
<li><p><strong>Pravidlo 70:30</strong> praví, že při MS/MS je v pasti možno stabilizovat fragmenty s hmotnostní o 70 % menší než zvolený prekurzor.</p>
</li>
</ul>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Sfericka_iontova_past_prurez_17a25c97dc/2-THETA-Sfericka-iontova-past-prurez.jpg" alt="2 THETA: Sférická iontová past průřez"/></p>
<h5><strong>LINEÁRNÍ IONTOVÁ PAST (LIT)</strong></h5>
<p>Lineární iontová past (někdy též označovaná jako dvourozměrná nebo 2D-iontová past) je v podstatě kvadrupól, který je schopen uchovávat ionty. Ve směru radiálním je toho dosaženo využitím „Rf-only“ modu (tj. na tyče kvadrupólu je vkládáno pouze radiofrekvenční napětí, bez stejnosměrné složky), ve směru axiálním (rovnoběžně s tyčemi kvadrupólu) se k omezení pohybu iontů využívá stejnosměrné napětí, vkládané buď na vstupní a výstupní kruhovou elektrodu nebo na segmenty tyčí kvadrupólu. V prvním případě se využívá axiálního vypuzení iontů z pasti [33], v druhém případě je ejekce radiální přes podlouhlé štěrbiny ve středních segmentech dvou protilehlých elektrod [34]. V obojím případě se toho dosahuje zvyšováním amplitudy radiofrekvenčního napětí vkládaného na tyče kvadrupólu, u segmentovaného kvadrupólu pouze na střední segment.</p>
<h5><strong>ANALYZÁTOR DOBY LETU (TIME-OF-FLIGHT, TOF)</strong></h5>
<p>Princip separace iontů na základě doby letu je znám již od roku 1946 [35]. Konstrukčně je TOF velmi jednoduchý, jedná se o evakuovanou trubici bez pole, nicméně k přesnému určení hodnoty <em>m/z</em> na základě velmi krátkých dob letu iontů je zapotřebí kvalitní elektroniky. Proto se dlouhou dobu tento analyzátor využíval pouze omezeně, až v posledních zhruba třech desítkách let lze pozorovat výraznou změnu. </p>
<h5><strong>IONTOVÁ CYKLOTRONOVÁ REZONANCE S FOURIEROVOU TRANSFORMACÍ (FT-ICR)</strong></h5>
<p>Tento analyzátor, poprvé popsaný roku 1974 [37], je výjimečný dosahovaným rozlišením (až řádu 106), ale i velikostí, pořizovacími a provozními náklady, požadavky na kvalitu vakua i nároky na obsluhu. Měřící cela umístěná v silném magnetickém poli B generovaném elektromagnety udržovanými v supravodivém stavu pomocí kapalného helia sestává ze 4 segmentů; vždy dva protilehlé jsou shodné – vysílač E a přijímač D. Ionty přivedené do této cely začnou v silném magnetickém poli vykonávat kruhový pohyb s tzv. cyklotronovou frekvencí.</p>
<h5><strong>ORBITRAP</strong></h5>
<p>Orbitrap je nejnovějším přírůstkem mezi hmotnostně spektrometrickými analyzátory; odborné veřejnosti byl představen roku 2000 [38]. Sestává ze dvou elektrod: vnější soudečkovité a vnitřní vřetenovité. Na tyto dvě elektrody je vkládáno napětí 3,5 – 5 kV, přičemž vnější elektroda bývá uzemněná. Dávka iontů je asymetricky přivedena do prostoru mezi elektrodami, ionty začnou opisovat kruhové dráhy, přičemž frekvence oscilace podél osy <em>z</em> je charakteristická pro každý poměr <em>m/z</em>. Oscilující ionty generují ve snímacích elektrodách proud, jehož frekvence nese informaci o poměru m/z a amplituda o množství iontů. Fourierovou transformací se pak záznam překlopí z domény časové do domény frekvenční.</p>
<h4><strong>Detektory</strong></h4>
<p>Detektory slouží k převodu intenzity iontového toku na elektricky měřitelnou a zpracovatelnou veličinu. V přístrojích pro organickou hmotnostní spektrometrii se používají následující typy detektorů:</p>
<ul>
<li><p><strong>Elektronásobič s kontinuální dynodou</strong> (continuous dynode electron multiplier, CEM, channeltron) je většinou skleněná trubice s vrstvou polovodivého PbO uvnitř. Vysoké napětí vkládané na polovodivou vrstvu vytváří potenciálový gradient (elektrické pole) podél trubice. Ion dopadající na polovodičovou vrstvu z ní vyrazí elektron, který je urychlený elektrickým polem a při dopadu na stěnu z ní vyrazí alespoň dva elektrony, a tento jev se opakuje po celé délce trubice. Toto zařízení se vyznačuje vysokou citlivostí a krátkou časovou konstantou, ale relativně krátkou životností.</p>
</li>
<li><p><strong>Elektronásobič s diskrétními dynodami</strong> má rovněž vysokou citlivost a relativně malou časovou konstantu. Proti channeltronu a MCP detektoru má dlouhou životnost. Dosahované zesílení závisí na napájecím napětí, řádově bývá 10⁶. Paralelně je možné měřit v analogovém režimu (signály s vysokou intenzitou)<br/>a v režimu čítání impulzů.</p>
</li>
<li><p><strong>Mikrokanálková destička</strong> (Microchannel plate detector, MCP) je vyrobena z vysoce odporového materiálu (nejčastěji skla) obvykle 1 mm silného o průměru 1–10 cm s velkým počtem (až miliony) drobných trubiček (microchannels) s průměrem přibližně 10 µm.</p>
</li>
</ul>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Mikrokanalova_desticka_3cce6e6b33/2-THETA-Mikrokanalova-desticka.jpg" alt="2 THETA: Mikrokanálková destička"/></p>
<h4><strong>Vakuový systém</strong></h4>
<p>Vzniká-li v nějakém uzavřeném prostoru podtlak zpravidla menší než 100 Pa, hovoříme o vakuu v daném prostoru. Stupeň vakua není terminologicky ustálen, rozlišujeme však nízké vakuum (předvakuum cca do 0,1 Pa), vysoké vakuum (do 10⁻⁴ Pa) a ultravysoké vakuum (od 10⁻⁶ Pa). Podle kinetické teorie plynů je tlak<br/>v nádobě způsoben nárazy molekul, případně atomů plynu, na její stěny. Čím menší je tedy tlak v nádobě, tím méně molekul nebo atomů plynu je přítomno. To je velmi důležité pro správnou funkci hmotnostních analyzátorů a detektorů iontů, případně i některých iontových zdrojů hmotnostních spektrometrů. V těchto přístrojích se pohybují ionty po poměrně dlouhých drahách řádu decimetrů až metrů a každá srážka s molekulou plynu v nádobě přístroje vyvolá ztrátu energie a rozptyl částic. Střední volná dráha těchto částic je definovaná jako aritmetický střed velkého počtu délek drah částice mezi dvěma po sobě  následujícími srážkami.</p>
<h5><strong>MECHANICKÉ VÝVĚVY</strong></h5>
<p>Nejrozšířenější mechanickou vývěvou je rotační olejová vývěva. Vývěvu tvoří dutý ocelový válec, ve kterém se otáčí válcový píst s osou rotace posunutou proti ose válce. V pístu se nachází drážka, do které jsou zasunuty dvě ocelové planžety roztahované proti stěně válce ocelovou pružinou, takže neustále přiléhají ke stěně. Ty působí jako písty a tlačí molekuly plynu ve směru otáčení. Celé těleso válce je ponořeno do speciálního minerálního oleje s nízkou tenzí par, který působí jako vakuové těsnění a mazivo. Rotační olejová vývěva může pracovat proti atmosférickému tlaku a používá se hlavně na vytvoření nízkého vakua cca 10¯¹ Pa a předvakua pro další čerpání.</p>
<p><strong>Molekulární vývěva</strong> je podobná svou konstrukcí rotační olejové vývěvě, ale asymetricky umístěný rotor nemá žádné planžety a molekulám čerpaného plynu je předán impuls ve směru čerpání rychle se pohybujícím pevným povrchem. Otáčky rotoru tohoto čerpadla jsou extrémně vysoké (16-20 000 ot/min), rotor<br/>musí být dokonale vyvážený a jeho hřídel je uložený v magnetické levitaci. Mezní tlak je kolem 10¯⁴ Pa, čerpací rychlost je malá.</p>
<p><strong>Turbomolekulární vývěva</strong> pracuje na stejném principu, jen s tím rozdílem, že molekuly plynu jsou odráženy ve směru čerpání pomocí rotoru s lopatkami. Tento typ vývěvy je velmi náročný na výrobu a tudíž drahý, ale dokáže čerpat od velmi nízkého vakua až do hodnot řádu 10¯¹¹ Pa, čerpací rychlost je do tisíců l/s, vakuum je velmi čisté. Molekulární vývěva nemůže pracovat proti atmosférickém tlaku, protože lopatky rotoru by se silným třením o čerpaný plyn zahřály a zničily, proto je používána v kombinaci s primární vývěvou (např. olejová rotační).</p>
<p>První 2 obrázky zleva - Rotační olejová vývěva (1-stator; 2-rotor; 3,4,5-části komory; 6,7-lopatky; 8-pružina; 9-výstupní ventil; 10-zachycovač oleje;11-filtr; 12,13-boční kryty; 14-osa; 15-hladina oleje), dále je Molekulární vývěva (1-stator; 2-rotor; 3,4,5-pracovní mezera) a na posledním obrázku je vyobrazen Rotor a stator turbomolekulární vývěvy.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Mechanicke_vyvevy_65dde12e96/2-THETA-Mechanicke-vyvevy.jpg" alt="2 THETA: Mechanické vývěvy"/></p>


Organická analýza - Hmotnostní spektrometrie (Analyzátory, Detektory, Vákuum)

Analýza anorganických látek - Hmotnostní spektrometrie

<h3><strong>6 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE</strong></h3>
<h5><strong>6.3 Tandemová hmotnostní spektrometrie</strong></h5>
<ul>
<li>6.3.1 Tandemové hmotnostní spektrometry na bázi sektorových analyzátorů</li>
<li>6.3.2 Trojitý kvadrupól (QQQ, QqQ)</li>
<li>6.3.3 Tandem TOF-TOF</li>
<li>6.3.4 Trojitý kvadrupól s lineární iontovou pastí (QqQLIT)</li>
<li>6.3.5 Q-TOF</li>
</ul>
<h5><strong>6.4 Mobilní hmotnostní spektrometrie</strong></h5>
<h5><strong>6.5 Hmotnostní spektrometrie izotopových poměrů (IRMS)</strong></h5>
<ul>
<li>6.5.1 Princip IRMS</li>
<li>6.5.2 Využití IRMS</li>
</ul>
<blockquote>
<p><strong>Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.</strong></p>
</blockquote>
<blockquote>
<p>💡 <strong>Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci <a href="https://lcms.cz/products/634">Organická analýza</a>, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.</strong></p>
</blockquote>
<h3><strong>Tandemová hmotnostní spektrometrie</strong></h3>
<p>Principem tandemové hmotnostní spektrometrie je izolace zvoleného iontu (tzv. prekurzoru, dříve rodičovského iontu) v prvním stupni, vyvolání jeho fragmentace dodáním energie v reakční oblasti a registrace produktového (dříve dceřiného) hmotnostního spektra. Toto spektrum se vztahuje pouze ke zvolenému prekurzoru, může tedy přispět k objasnění jeho struktury. Tandemová hmotnostní spektrometrie se začala rozvíjet od počátku 60. let minulého století v souvislosti se zkoumáním tzv. metastabilních iontů (tj. iontů, které se rozpadají během letu hmotnostním spektrometrem), jejichž zastoupení bylo uměle zvyšováno kolizemi s inertním plynem cíleně přiváděným do určité oblasti hmotnostního spektrometru. Za zakládající publikací této disciplíny je považována kniha R.G. Cookse a kol. „Metastable Ions“ z roku 1973 [39]. Základní tři kroky tandemové hmotnostní spektrometrie se mohou odehrávat buď v prostoru (ionty prolétávají určenou trajektorii, jednotlivé kroky probíhají simultánně), nebo v čase (ionty zůstávají ve stejném místě, jednotlivé kroky probíhají v časové posloupnosti). Do první skupiny patří přístroje využívající sektorových analyzátorů, kvadrupólů a průletových analyzátorů, do druhé pak analyzátory uchovávající ionty – iontové pasti. a iontová cyklotronová rezonance. Hybridní systémy pak využívají současně analyzátory z obou skupin.</p>
<h5>V MS/MS se využívají čtyři základní experimenty:</h5>
<ul>
<li>Sken produktů (Product scan)</li>
<li>Sken prekurzorů (Precursor Scan)</li>
<li>Sken konstantní neutrální ztráty (Constant Neutral Loss Scan)</li>
<li>Sledování vybrané fragmentace / vybraných fragmentací (MRM – Multiple Reaction Monitoring)</li>
</ul>
<h4><strong>Tandemové hmotnostní spektrometry na bázi sektorových analyzátorů</strong></h4>
<p>První experimenty s tandemovou hmotnostní spektrometrií byly prováděny na dvousektorových analyzátorech s obrácenou geometrií (BE). Tato technika se označuje jako MIKES (Mass-analyzed Ion Kinetic Energy Spectrometry). </p>
<h4><strong>Trojitý kvadrupól (QQQ, QqQ)</strong></h4>
<p>Trojitý kvadrupól je využíván v tandemové hmotnostně spektrometrické analýze organických sloučenin již od roku 1979 [41]. Klíčem k jeho využití byl objev možnosti kolizně indukované disociace iontů v kvadrupolu operovaném v Rf-only modu [42]. Schéma tohoto uspořádání je na Obrázku níže. První kvadrupól Q1 nejčastěji slouží k výběru prekurzoru – iontu, který má být podrobněji studován, druhý Q2 slouží jako kolizní cela, do které je přiváděn terčový plyn (nejčastěji Ar nebo N₂) a dochází zde ke kolizně indukované disociaci (srážky iontů a neutrálních molekul terčového plynu vyvolávají fragmentaci iontů). Poslední Q3 pak provádí skenování produktů nebo sleduje pouze vybraný fragment charakteristický pro analyzovanou sloučeninu.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Trojity_kvadrupol_5db8291656/2-THETA-Trojity-kvadrupol.jpg" alt="2 THETA: Trojitý kvadrupól"/></p>
<p>Trojitý kvadrupól je velmi oblíben ve spojení s chromatografickými separačními technikami. Zejména v modu MRM umožňuje dosažení velice dobrých mezí detekce.</p>
<h4><strong>Tandem TOF-TOF</strong></h4>
<p>Dva průletové analyzátory za sebou našly svoje uplatnění zejména ve spojení s ionizační technikou MALDI. První analyzátor fungující v lineárním modu slouží k výběru prekurzoru, který je iontovou bránou vpuštěn do kolizní cely a odtud do druhého analyzátoru s reflektronem. Tyto systémy našly svoje uplatnění zejména v proteomice při sekvenování biopolymerů. Vyznačují se naprosto minimálními nároky na množství vzorku – k měření postačí attomoly analyzované substance. </p>
<h4><strong>Trojitý kvadrupól s lineární iontovou pastí (QqQLIT)</strong></h4>
<p>Tento hybridní analyzátor je v podstatě trojitým kvadrupólem, kde namísto třetího kvadrupólu je lineární iontová past. Tento systém může fungovat jako plnohodnotný trojitý kvadrupól, s využitím možností lineární iontové pasti je možno provádět i MS³ . Systémy tohoto typu nacházejí svoje uplatnění v proteomice, analýze životního prostředí, kontrole potravin a v dalších aplikacích.</p>
<h4><strong>Q-TOF</strong></h4>
<p>Tento systém opět vychází z trojitého kvadrupólu, kde třetí kvadrupól je nahrazen ortogonálně zařazeným analyzátorem doby letu. První a druhý kvadrupól fungují standardním způsobem, ionty vycházející z kolizní cely jsou pulsní elektrodou s nastavenou frekvencí vystřelovány v kolmém směru do průletového analyzátoru s jedním reflektronem (V-trajektorie), případně dvěma (W-trajektorie). Oproti trojitému kvadrupólu tento systém umožňuje analýzu produktů s vysokým rozlišením, díky vlastnostem analyzátoru TOF je možno registrovat plná produktová spektra s citlivostí charakteristickou pro MRM mód trojitého kvadrupólu. Tyto systémy nacházejí uplatnění v metabolomice, proteomice, biofarmaceutickém a farmaceutickém výzkumu, při kontrole bezpečnosti potravin, v toxikologii, v kriminalistice i v dalších oblastech.</p>
<h3><strong>Mobilní hmotnostní spektrometrie</strong></h3>
<p>Miniaturizace našla svoje uplatnění i v oblasti hmotnostní spektrometrie, díky čemuž lze dnes využít tuto techniku i přímo v místě odběru vzorku. Jako příklad lze uvést přístroj MX908 firmy 908devices (Boston, Ma, USA), jehož hmotnost (4,3 kg) i malé rozměry dovolují držet jej v rukách. Přístroj využívá elektronové ionizace a miniaturní sférické iontové pasti operované za horšího vakua, než je ve standardních analyzátorech (tzv. HPMS – High Pressure Mass Spectrometry), a je napájen z baterií. Po zapnutí je přístroj připraven k měření zhruba za 1 minutu. Přístroj může analyzovat pevné, kapalné i plynné vzorky včetně aerosolů. Jeho ovládání je mimořádně jednoduché a díky vestavěné knihovně hmotnostních spekter je možno spolehlivě identifikovat celou řadu sloučenin ze skupiny výbušnin, bojových chemických látek, drog a nebezpečných chemikálií, a to na koncentrační hladině podstatně nižší než u FTIR nebo Ramanovy spektrometrie [43].</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Prenosny_hmotnostni_spektrometr_MX_908_fe96abfe7d/2-THETA-Prenosny-hmotnostni-spektrometr-MX908.jpg" alt="2 THETA: Přenosný hmotnostní spektrometr MX908"/></p>
<h3><strong>Hmotnostní spektrometrie izotopových poměrů (IRMS)</strong></h3>
<h4><strong>Princip IRMS</strong></h4>
<p>Princip IRMS Hmotnostní spektrometrie izotopových poměrů (IRMS, Isotope Ratio Mass Spectrometry), někdy označovaná též jako izotopová poměrová hmotnostní spektrometrie, se zabývá sledováním poměrů stabilních izotopů vybraných prvků. U organických sloučenin jsou nejčastěji analyzovány izotopy uhlíku (¹³C/¹²C), kyslíku (¹⁸O/¹⁶O), dusíku (¹⁵N/¹⁴N), vodíku (D/H) a síry (³⁴S/³²S). Princip metody je relativně jednoduchý: Analyzované vzorky se převádějí do formy jednoduchých plynných sloučenin (CO₂ pro uhlík, CO pro kyslík, N₂ pro dusík, H₂ pro vodík, SO₂ pro síru), které jsou vedeny do hmotnostního spektrometru s elektronovou ionizací, magnetickým analyzátorem a několika (nejčastěji třemi nebo pěti) Faradayovými detektory. Schéma přístroje je uvedeno na níže.</p>
<p><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/2_THETA_Schema_hmotnostniho_spektrometru_izotopovych_pomeru_b004d149db/2-THETA-Schema-hmotnostniho-spektrometru-izotopovych-pomeru.jpg" alt="2 THETA: Schéma hmotnostního spektrometru izotopových poměrů"/></p>
<p>K převedení vzorku na jednoduché plynné sloučeniny lze využít řady metod v závislosti na skupenství vzorku. Pro pevné vzorky se využívá elementární analyzátor, který spalováním v proudu kyslíku, následnou redukcí oxidů dusíku a záchytem vodních par produkuje CO₂ a N₂, nebo vysokoteplotní pyrolýzou vzniká CO. Kapalné vzorky mohou být dávkovány do elementárního analyzátoru pomocí dávkovače kapalin, případně uzavřené ve speciálních kapslích; další postup je stejný jako u pevných vzorků. Alternativní možností je rozklad kapalného vzorku koncentrovanou kyselinou fosforečnou, oxidace peroxodisíranem a převod plynných produktů do hmotnostního spektrometru. V případě potřeby separace složek vzorku je možno využít kapalinové chromatografie a do rozkladného zařízení pak převést pouze vybraný pík. Plynné vzorky mohou být dávkovány do hmotnostního spektrometru přes zařízení umožňující stanovení izotopického složení CO₂ a N₂O, případně i CH₄ po jeho spálení. Další možností je plynově chromatografická separace následovaná přenosem vybraných píků do spalovacího zařízení, vysušení spalin a analýza vzniklého CO₂ a N₂ v hmotnostním spektrometru.</p>
<p>Výstupy z hmotnostního spektrometru izotopových poměrů jsou hodnoty relativní; primárním údajem je poměr četnosti iontu obsahujícího minoritní (zpravidla těžší) izotop k četnosti iontu obsahujícího majoritní (zpravidla lehčí) izotop - např. pro izotopickou analýzu uhlíku se registruje ion <em>m/z</em> 44 (¹²C ¹⁶O₂) a 45 (¹³C ¹⁶O₂); za účelem korekce signálu <em>m/z</em> 45 na příspěvek ¹²C ¹⁷O ¹⁶O se sleduje rovněž intenzita signálu m/ z 46 (¹²C ¹⁸O ¹⁶O), k níž ovšem malou měrou přispívá i ¹³C ¹⁷O ¹⁶O.</p>
<h4><strong>Využití IRMS</strong></h4>
<p>Zdrojem informace získávaného pomocí IRMS jsou procesy označované jako izotopická frakcionace, ke kterým v přírodě dochází v rámci přirozených koloběhů sledovaných prvků. Izotopy vykazují v podstatě stejné chemické vlastnosti, neboť ty jsou určovány počtem elektronů ve valenčních sférách (jistý rozdíl je v reakční kinetice – mírně rychleji reagují molekuly s lehčími izotopy, a rovněž vazby tvořené těžšími izotopy jsou pevnější). Rozdíl v atomové hmotnosti izotopů (a potažmo i sloučenin je obsahujících) je příčinou rozdílů v jejich fyzikálních vlastnostech, které pak vedou k izotopické frakcionaci. </p>


Organická analýza - Hmotnostní spektrometrie (Tandemová, Mobilní, IRMS)

Analýza anorganických látek - Metody rentgenové analýzy 1/3

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

PFAS

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

2 THETA ASE, s.r.o. byla založena v roce 2000. Rozsah jejích činností zahrnuje obchod s laboratorními přístroji, vybavením laboratoří, referenčními materiály, nástroji a zařízením pro odběr a úpravu vzorků, atd. Firma také organizuje odborné a vzdělávací akce a zajišťuje pomoc při aplikacích mikrovlnné techniky ve výzkumu a výrobě. 

2 THETA ASE

19th Czech - Slovak Spectroscopic Conference (CSSC) & Mössbauer Spectroscopy in Material Science (MSMS)

Altium Multi-Omics Solutions Day at CEITEC

Waters Softwarové školení Empower Basic

Polymeric, porous, monodisperse particle development and application to reversed-phase separations of biological molecules

Navigating PFAS Restrictions in Packaging and Packaging Waste (PPRW) with Py-GC-MS

Using Targeted Methylation Sequencing to Bring Epigenetic Biomarkers to the Clinic