Iontově výměnná chromatografie (IEX) je významná separační technika, která umožňuje dělení ionizovatelných látek podle jejich náboje. Díky kombinaci svých vlastností představuje účinnou chromatografickou metodu, protože:<ul><li>umožňuje zpracování velkých objemů vzorku,</li><li>má široké možnosti využití, zejména při separaci enzymů a proteinů,</li><li>poskytuje vysokou rozlišovací schopnost,</li><li>umožňuje snadnou automatizaci,</li><li>lze ji snadno škálovat,</li><li>kombinuje dobré separační vlastnosti s přijatelnými náklady.</li></ul><h3>Princip iontově výměnné chromatografie</h3>Princip iontově výměnné chromatografie je založen na reverzibilní výměně iontů mezi mobilní fází, tedy kapalným roztokem obsahujícím vzorek, a stacionární fází tvořenou pevným nosičem s nabitými funkčními skupinami. Podle typu náboje stacionární fáze rozlišujeme:<ul><li>Katexovou chromatografii (výměna kationtů): stacionární fáze obsahuje záporně nabité skupiny, které přitahují a vážou kladně nabité ionty (kationty).</li><li>Anexovou chromatografii (výměna aniontů): stacionární fáze obsahuje kladně nabité skupiny, které přitahují a vážou záporně nabité ionty (anionty).</li></ul>Po nanesení vzorku na kolonu soutěží ionty obsažené ve vzorku s protiionty vázanými na stacionární fázi o vazebná místa. Síla této interakce závisí na několika faktorech, mimo jiné na hustotě náboje a velikosti jednotlivých iontů. Ionty s vyšší hustotou náboje se obvykle vážou ke stacionární fázi silněji než ionty s nižší hustotou náboje.Tato technika se využívá v různých oblastech farmaceutického průmyslu díky své schopnosti separovat různé typy požadovaných nabitých molekul. Široké uplatnění nachází při purifikaci enzymů, aminokyselin, proteinů, protilátek, jednodušších sacharidů, organických sloučenin a nukleových kyselin.<blockquote>Prozkoumejte <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/techniques/hplc-ion-exchange">techniku iontově výměnné chromatografie</a> a dosáhněte účinné separace v chromatografických aplikacích.</blockquote><h3>Postup iontově výměnné chromatografie – jak funguje?</h3>Proces iontově výměnné chromatografie lze rozdělit do několika fází:<ul><li>Ekvilibrace: Kolona se ekvilibruje pufrem s pH vhodným pro optimální vazbu cílových analytů.</li><li>Nanesení vzorku: Vzorek se nanese na kolonu, kde jeho nabité složky interagují s opačně nabitými místy stacionární fáze. Tyto interakce ovlivňují míru retence jednotlivých molekul.</li><li>Promývání: Kolona se promyje pufrem, aby se odstranily nevázané nebo slabě vázané nečistoty.</li><li>Eluce: Navázané molekuly se eluují postupným zvyšováním koncentrace soli nebo změnou pH. Tím se mění náboj analytů a usnadňuje jejich uvolnění ze stacionární fáze.</li><li>Sběr a analýza: Eluované frakce se shromažďují a následně analyzují například pomocí UV spektroskopie nebo hmotnostní spektrometrie za účelem identifikace a kvantifikace separovaných složek.</li></ul><h3>Aplikace iontově výměnné chromatografie</h3><ul><li>Purifikace proteinů a enzymů: Široce se využívá k izolaci a purifikaci proteinů, enzymů a dalších biomolekul na základě jejich náboje.</li><li>Separace nukleových kyselin: Využívá se k separaci a purifikaci DNA, RNA a oligonukleotidů.</li><li>Analýza aminokyselin: Uplatňuje se při analýze a kvantifikaci aminokyselin v komplexních vzorcích.</li><li>Farmaceutický průmysl: Využívá se při formulaci léčiv, kontrole kvality a purifikaci biofarmaceutik.</li><li>Úprava vody: Slouží k odstraňování nežádoucích iontů z vody, například iontů vápníku a hořčíku způsobujících její tvrdost.</li><li>Potravinářský a nápojový průmysl: Využívá se při čištění potravinářských aditiv, odstraňování kontaminantů a zlepšování kvality produktů.</li><li>Analýza metabolitů: Usnadňuje identifikaci a separaci malých nabitých metabolitů.</li></ul><h3>Hlavní výhody iontově výměnné chromatografie</h3><ul><li>Jednou z hlavních výhod je schopnost separovat molekuly podle jejich náboje, který představuje základní vlastnost mnoha biomolekul, jako jsou proteiny, peptidy a nukleové kyseliny.</li><li>Další významnou výhodou je její univerzálnost. Iontově výměnnou chromatografii lze provozovat za různých podmínek, včetně změn pH, koncentrace solí a teploty, což umožňuje separaci širokého spektra molekul. Tato flexibilita rozšiřuje možnosti jejího využití v různých oblastech výzkumu, od farmacie až po environmentální analýzu.</li><li>Iontově výměnná chromatografie navíc nabízí vysoké rozlišení a dobrou reprodukovatelnost, což umožňuje purifikovat požadované molekuly s vysokou výtěžností. Metodu lze rovněž snadno škálovat, takže je vhodná jak pro laboratorní použití v malém měřítku, tak pro průmyslové aplikace ve velkém měřítku.</li></ul><h3>Omezení iontově výměnné chromatografie</h3><ul><li>Jedním z významných omezení je její citlivost na pH a iontovou sílu. pH mobilní fáze musí být pečlivě kontrolováno, protože jeho změny mohou ovlivnit ionizační stav analytů i stacionární fáze, což může vést k neúplné separaci nebo nízkému rozlišení. Rovněž je nutné optimalizovat iontovou sílu elučního pufru. Pro eluci silně vázaných analytů jsou často zapotřebí vysoké koncentrace solí, což může být problematické u citlivých sloučenin, které mohou za těchto podmínek precipitovat nebo ztrácet svou aktivitu.</li><li>Dalším omezením je možnost degradace vzorku. Vysoké koncentrace solí a extrémní hodnoty pH potřebné pro eluci mohou vést k denaturaci proteinů nebo destabilizaci citlivých biomolekul. Kapacita iontoměničových kolon je navíc omezená, a proto je nutné pečlivě řídit množství nanášeného vzorku. Přetížení kolony může způsobit zhoršení separace a snížení rozlišení.</li><li>Iontově výměnná chromatografie může být také poměrně časově náročná, protože eluce často využívá postupné gradienty koncentrace solí nebo pH, které mohou prodlužovat dobu analýzy. Metoda navíc není vhodná pro všechny typy analytů, zejména pro neiontové sloučeniny nebo látky, které za použitých podmínek nevykazují dostatečné rozdíly v náboji.</li></ul>

Principy iontově výměnné chromatografie: Komplexní průvodce

<h3>Za hranicí přesných shod: manuální a automatizované hybridní vyhledávání v NIST26</h3>Konvenční vyhledávání v knihovnách MS/MS spekter funguje nejlépe tehdy, když spektrum neznámé sloučeniny dobře odpovídá referenčnímu spektru, které je již v knihovně uloženo. Reálné vzorky však často obsahují látky, které v dostupných knihovnách chybějí. James Little ze společnosti Mass Spec Interpretation Services ve své prezentaci <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Manual_and_Automated_Hybrid_searches_44b28ae6a0.pdf">Manual and Automated Hybrid Searches in NIST26</a> ukazuje, jak mohou možnosti hybridního vyhledávání v NIST26 rozšířit prakticky využitelné pokrytí knihovny. Umožňují vyhledávat strukturně příbuzné sloučeniny a využít vztahy mezi jejich spektry jako vodítko při identifikaci neznámých látek.<h4>Rozšíření vyhledávání v knihovnách MS/MS za hranici přesných shod</h4>Konvenční vyhledávání v knihovně se snaží nalézt spektra, která se co nejvíce podobají naměřenému spektru. Pokud je k dispozici odpovídající referenční spektrum, může tento přístup poskytnout velmi spolehlivou identifikaci. Jeho možnosti se však výrazně omezují v případě, kdy samotná neznámá sloučenina v knihovně chybí.Funkce Hybrid MS/MS Search v programu NIST Mass Spectral Search Program využívá jiný přístup. Nevyžaduje přesnou spektrální shodu, ale dokáže rozpoznat spektra strukturně příbuzných sloučenin a zohlednit systematické rozdíly v hmotnosti mezi neznámou látkou a kandidáty z knihovny. Díky tomu lze existující referenční spektra využít i při zkoumání sloučenin, které dosud nebyly samy změřeny a zařazeny do knihovny.V NIST26 lze hybridní vyhledávání provádět dvěma způsoby:<ul><li>manuálně odesláním jednotlivých spekter do okna Library Search,</li><li>automaticky v rámci pracovního postupu Chromatogram.</li></ul>Oba přístupy se vzájemně doplňují. Automatizované vyhledávání umožňuje rychle prověřit velké množství chromatografických komponent, zatímco manuální vyhledávání dává analytikovi více prostoru pro detailní posouzení jednotlivých kandidátů a jejich struktur.<h4>Využití hmotnostních rozdílů k rozpoznání strukturních vztahů</h4>Důležitou součástí hybridního vyhledávání je interpretace hmotnostního rozdílu mezi spektrem neznámé látky a spektrem příbuzné sloučeniny z knihovny.NIST26 tento rozdíl uvádí společně s parametrem Δform (dForm), který představuje možný elementární vzorec odpovídající pozorovanému posunu hmotnosti. Namísto toho, aby byl odlišný prekurzorový ion považován za důkaz, že spolu dvě sloučeniny nesouvisejí, může software posoudit, zda daný rozdíl odpovídá chemicky smysluplné strukturní modifikaci.Prezentace rovněž upozorňuje na parametr pctRefForm, statistický ukazatel související s tím, jak často se daný dForm vyskytuje ve srovnání s běžně pozorovanými strukturními změnami. Vyšší hodnoty odpovídají častějším, a tedy obecně pravděpodobnějším rozdílům ve vzorci. Naopak velmi vzácné rozdíly mohou být náhodné a je třeba je interpretovat opatrně.Tyto doplňující informace posouvají výsledek knihovního vyhledávání od pouhé spektrální podobnosti směrem k výchozímu bodu pro strukturní interpretaci.<h4>Manuální postup pro zkoumání neznámých chromatografických komponent</h4>James Little představuje praktický postup, při kterém je nejprve provedeno standardní vyhledávání chromatogramu a následně jsou k dalšímu zkoumání vybrány komponenty, u nichž nebylo dosaženo spolehlivé identifikace.Neidentifikované komponenty lze seřadit podle relativní intenzity, takže se analytik může nejprve zaměřit na nejvýznamnější signály. Jednotlivá spektra je následně možné procházet, porovnávat například pomocí tzv. butterfly plots, a zajímavé komponenty ručně odeslat do okna Library Search pro hybridní vyhledávání.Tento postup je užitečný zejména tehdy, když standardní automatizované vyhledávání neposkytne uspokojivou identifikaci, ale spektrum stále obsahuje dostatek strukturních informací k tomu, aby bylo možné určit příbuznou skupinu sloučenin.<h4>Identifikace neznámé látky související s PEG</h4>Prezentace celý postup demonstruje na neznámé látce související s materiály na bázi polyethylenglykolu (PEG). Ve spektru byl pozorován amonný adukt (M+NH₄)⁺ následovaný ztrátou amoniaku.Hybridní vyhledávání poskytlo kandidáty odpovídající PEG etherům, přičemž jako nejpravděpodobnější interpretace byl vyhodnocen dodecylether polyethylenglykolu. Navržený knihovní kandidát byl následně analyzován pomocí nástroje NIST MS Interpreter s cílem lépe porozumět jeho fragmentačnímu chování.Zvláště důležitou informaci poskytl pozorovaný hmotnostní rozdíl. Parametr dForm ukázal na ztrátu odpovídající třem opakujícím se jednotkám ethylenglykolu, přičemž pozorovaná hodnota 132,079 přesně odpovídala teoretické hodnotě 132,079. Tato shoda dále podpořila předpoklad, že neznámá látka a kandidát z knihovny patří do stejné strukturní skupiny, liší se však délkou PEG řetězce.Strukturu kandidáta bylo následně možné upravit odstraněním tří opakujících se jednotek ethylenglykolu a znovu ji odeslat do nástroje MS Interpreter k dalšímu posouzení. Tento příklad dobře ukazuje, že hybridní vyhledávání umožňuje posunout se od jednoduché otázky „Která sloučenina se nachází v knihovně?“ k mnohem užitečnější otázce „Jak se může moje neznámá látka lišit od nejbližší známé struktury?“<h4>Proč vyžadují amonné adukty zvláštní pozornost</h4>Chemie aduktů může vyhledávání v knihovnách MS/MS komplikovat. V uvedeném příkladu byl experimentální prekurzor pozorován jako (M+NH₄)⁺, zatímco knihovna NIST MS/MS obsahuje více spekter získaných z prekurzorů (M+H)⁺.Prezentace upozorňuje, že při získávání referenčních spekter NIST není amonium záměrně přidáváno. Pokud tedy analytik pozoruje ztrátu 17 Da, odpovídající NH₃, může být užitečné vzít v úvahu, že následná fragmentace ve skutečnosti odpovídá protonované molekule.V takových případech Little doporučuje nahradit při vyhledávání hodnotu prekurzoru odpovídající hodnotou (M+H)⁺, namísto použití pouze prekurzoru zobrazeného v experimentálním spektru.V případě PEG vedl tento postup stále ke dvěma kandidátům z oblasti monodecylových etherů jako k nejlepším shodám. Důležité je, že podle prezentace byly hlavní fragmenty MS/MS vznikající z amonného i protonovaného prekurzoru v zásadě stejné. To podporuje možnost porovnání s referenčními spektry protonovaných molekul.<h4>Automatizace hybridního vyhledávání v celém chromatogramu</h4>Manuální posouzení je velmi užitečné při analýze menšího počtu významných neznámých sloučenin, chromatografická data však mohou obsahovat stovky komponent. NIST26 proto umožňuje provádět hybridní vyhledávání také automatizovaně přímo v rámci pracovního postupu Chromatogram.Analytik vybere vstupní soubor, aktivuje možnost Hybrid Search a může zvolit spuštění analýzy na pozadí. Protože hybridní vyhledávání provádí výrazně více výpočetních operací než standardní postup, může podle prezentace trvat podstatně déle. NIST26 zobrazuje stav úlohy běžící na pozadí a po dokončení zpracování uživatele upozorní.Výsledné komponenty lze následně filtrovat tak, aby se analytik zaměřil například pouze na neidentifikované látky, a seřadit je podle jejich intenzity. V prezentovaném příkladu automatizované vyhledávání poskytlo stejného kandidáta souvisejícího s PEG jako předchozí manuální analýza, což ukazuje dobrou shodu mezi oběma přístupy.Automatizované hybridní vyhledávání tak může sloužit jako efektivní nástroj pro prvotní screening. Vybrané výsledky lze následně přesunout do okna Library Search a detailněji posoudit struktury kandidátů i jejich fragmentační chování.<h4>Od shody v knihovně k interpretaci struktury</h4>Hybridní vyhledávání nenahrazuje odbornou interpretaci výsledků. Rozšiřuje však množství informací, které má analytik k dispozici v situaci, kdy přesné referenční spektrum neznámé látky v knihovně chybí.Kombinací spektrální podobnosti, rozdílů v hmotnosti prekurzorů, pravděpodobných hodnot dForm, interpretace fragmentace a úprav navržených struktur poskytuje NIST26 workflow, které umožňuje postupovat od neidentifikovaného chromatografického signálu směrem k chemicky smysluplnému kandidátovi.Prezentace ukazuje, že nejefektivnějším přístupem je často kombinace automatizace a manuální interpretace. Automatizované vyhledávání umožňuje odhalit slibné vztahy napříč rozsáhlými datovými soubory, zatímco cílená manuální analýza pomáhá ověřit, zda jsou tyto vztahy chemicky smysluplné. Hybridní vyhledávání tak rozšiřuje praktickou hodnotu spektrálních knihoven i za hranici sloučenin, které jsou v nich přímo zastoupeny, a umožňuje jejich efektivnější využití při studiu dosud necharakterizovaných analytů.

Manuální a automatizované hybridní vyhledávání v NIST26

Zveme Vás na praktický kurz Škola SW Chromeleon 7, jehož cílem je seznámit účastníky s praktickým využitím <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://labrulez.com/cs-cz/all/products/76">SW Chromeleon 7 </a>při využití v LC/GC/IC/MS. Kurz je určen pro začátečníky i uživatele softwaru Chromeleon (bude demonstrován na verzi 7.3.2, ale je určen i pro účastníky s jinou verzí).<ul><li>📅Datum: 21. 10. + 22. 10. + 23. 10. 2026</li><li>🕘Čas: 09:00 - 12:00</li><li>📍Místo: online</li></ul><blockquote>👉<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://forms.cloud.microsoft/Pages/ResponsePage.aspx?id=aR-wpy9pT0iMxW5H7RJK8WO2jiQLb7NOszjVkgYyezJUMlE5QTkxRjFBNjBRU1QxUUlXQ0JZRDRPOC4u">Registrace</a>Kapacita je omezená, žádáme Vás o registraci</blockquote><h4>Cena kurzu</h4><ul><li>Den 1 + Den 2 -&gt; 5300 Kč bez DPH/osoba</li><li>Den 1 + Den 2 + Den 3 -&gt; 7400 Kč bez DPH/osoba</li></ul><h4>Lektoři:</h4><ul><li>Ing. Radim Kruliš (HPLC, IC, LC-MS)</li><li>Mgr. Petr Šulc (HPLC, LC-MS)</li><li>Ing. Petra Dinisová (Aplikační specialista)</li></ul><h3>Program</h3><h5>1. den</h5><ul><li>Intro, CM Architecture, Config, Admin Console</li><li>CM Console, Instrument Control, ePanels, Commands</li><li>CM Console, Data Category, Sequence editor, Instrument Audit Trail</li><li>CM Studio, Instrument Method Editor (+Script editor)</li></ul><h5>2.den</h5><ul><li>CM Studio, Data Processing, Data Audit Trail</li><li>CM Studio, Data Processing, Report Designer, Data Export</li></ul><h5>3.den</h5><ul><li>Úvod do zpracování LCMS a GCMS dat</li><li>CM Studio, Mass spektra, MS autofilters, MS components</li><li>Diskuze, vyhodnocení, certifikáty, ukončení</li></ul>Součástí každého dne bude i prostor pro diskuzi, kurzy však nejsou zaměřeny na řešení individuálních problémů. V případě potřeby takovéhoto řešení či jakýchkoli jiných dotazů nás neváhejte kontaktovat na eliasova@pragolab.cz nebo +420 771 137 630.Těšíme se na Vás.Váš tým Pragolab s.r.o.

Pozvánka na online praktický kurz Škola SW Chromeleon 7 při využití v LC/IC/GC/MS

Akademie

Software

Článek

Video

Nejbližší akce

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Phenomenex

Jsme jedním z lídrů na českém a slovenském trhu v oblasti laboratorních zařízení a svým zákazníkům přinášíme špičkové přístroje z oboru analytické chemie a fyzikálních měření více než 25 let.

Pragolab

Mým hlavním zájmem je identifikace organických sloučenin hmotnostní spektrometrií v organických směsích.

James Little/Mass Spec Interpretation Services

Agilent 1260 Infinity HPLC preparativní autosampler, G2260A (Bazar)

Agilent Technologies G2260A preparativní autosampler pro systémy Agilent 1260 Infinity zajišťující přesné a reprodukovatelné vysokobjemové nástřiky pro spolehlivou purifikaci látek.

Agilent 1100 series Fraction Collector, preparativní, G1364B (Bazar)

Preparativní sběrač frakcí pro systémy Agilent 1100 umožňující průtoky až 100 mL/min, flexibilní nádoby a pokročilé režimy spouštění.

Agilent 1260 Infinity HPLC Prep ALS (G2260A) (Bazar)

Agilent Technologies G2260A Prep ALS je špičkový autosampler přizpůsobený pro velkoobjemový nástřik vzorků s nekompromisní přesností, což z něj činí preferovanou volbu pro aplikace preparativní chromatografie.

Agilent Prep Mast Kit, 1,200 mL PCG0393411003 (Bazar)

Agilent Prep Mast Kit je určen pro systémy Agilent SD-2 a nabízí spolehlivý výkon při práci s velkými objemy v preparativních aplikacích. Díky kapacitě 1 200 ml podporuje konzistentní čištění a zpracování vzorků ve velkém měřítku v laboratorní praxi.

Bazar produkty zaměřené na PrepLC ve stavu repasovaný od Agilent Technologies - strana 1

Mohlo by Vás zajímat

Principy iontově výměnné chromatografie: Komplexní průvodce

Pozvánka na online praktický kurz Škola SW Chromeleon 7 při využití v LC/IC/GC/MS

Manuální a automatizované hybridní vyhledávání v NIST26