<h3>Cíl práce</h3>
Na platformě ověřené komerční metody fy <a href="https://lcms.cz/products?manufacturerItems=56">RECIPE</a> pro stanovení <a href="https://lcms.cz/library?search=d%E2%82%82%252fd%E2%82%83&amp;manufacturerItems=53">25-hydroxy-vitaminů D₂/D₃</a> v plasmě či séru vyvinout robustní a spolehlivou metodu DBS, která je pro pacienta atraktivní s ohledem na korespondenční formu méně invazivního odběru vzorků.
<h3>Úvod</h3>
„Vitamín D“ zahrnuje skupinu steroidů, které hrají klíčovou roli v inkorporaci vápníku do kostní hmoty, v buněčné proliferaci, pozitivní vliv vyšších hladin ergokalciferolu (D₂) zejména cholekalciferolu (D₃) na úroveň humorální imunitní připravenosti organismu a modulaci jeho protizánětlivé odpovědi (v konotaci s vážnými průběhy COVID-19 – cytokinová bouře – velmi pozoruhodná role!). V prevenci i pozitivní vliv na DM I. i II. typu, homeostasis TK,…
<h5>Mimotělní zdroje vitaminu D₂:</h5>
<ul>
<li>sušené houby (UV – na slunci)</li>
<li>kvasinky (S. cerevisiae) – kvasnice (český chléb)</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Ergosterol_zdroj_vitaminu_D2_houby_S_cerevisiae_2d3deee692/Ergosterol-zdroj-vitaminu-D2-(houby-S.cerevisiae).png" alt="Ergosterol – zdroj vitaminu D₂ (houby, S.cerevisiae)"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/ADAPTACE_METODY_RECIPE_VITAMIN_D2_D3_IN_PLASMA_AND_SERUM_1_d98e173213/ADAPTACE-METODY-RECIPE-VITAMIN-D2-D3-IN-PLASMA-AND-SERUM-1.png" alt=""/>
<h5>Mimotělní zdroje vitaminu D₃:</h5>
<ul>
<li>Potraviny živočišného původu (ryby, zejména tresčí játra)</li>
<li>Potraviny rostlinného původu – č. Solanaceae – zejména rajčata a brambory, obsah D₃ a 7-dehydrocholesterolu klesá ve směru: listy – plody – stonky - oddenky(hlízy)</li>
<li>Obiloviny (zejména oves), tzv. fortifikovaná rostlinná mléka (ovesné, mandlové, kokosové)</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/ADAPTACE_METODY_RECIPE_VITAMIN_D2_D3_IN_PLASMA_AND_SERUM_2_6f7343a2f9/ADAPTACE-METODY-RECIPE-VITAMIN-D2-D3-IN-PLASMA-AND-SERUM-2.png" alt="Cholekalciferol - zdroj vitamínu D₃ (Potraviny živočišného a rostlinného původu, Obiloviny)"/>
Biologicky Aktivní formy jsou steroly: 25(OH)D2, 25(OH)D3 - biosynthesa v játrech 1α,25(OH)2D2/D3 – biosynthesa v ledvinách (KALCITRIOL) - přes 25(OH)D2/D3 (stimulace parathormonem – příštítná tělíska).
Dostatečná expozice slunečnímu světlu (UV-B) znamená rychlou biosynthesu (konverzi) D₂ na klíčový D₃. V zimním a časném jarním období klimatu mírného pásma je potom vhodná dieta bohatá na kalciferol nezbytná pro udržení dostatečné imunitní obranyschopnosti. Optimální denní dávka vitaminu D₃ ve věkovém rozpětí 1 – 70 let bez ohledu na pohlaví je 15 µg (Zákon č. 352/2009 Sb. ,DDD je od 25 let věku výše jen 5 µg). Aktivní metabolit 1,25-dihydroxycholekalciferol hraje důležitou regulační roli v produkci antimikrobiálních peptidů (např. katelicidinu). Kalcitriol je steroidní hormon přes parathormon (hydroxylace v tkáni ledvin) zajišťuje biologickou dostupnost vápníku pro jeho inkorporaci do kostní hmoty.
<ul>
<li>VITAMIN D₂ – ERGOKALCIFEROL </li>
<li>VITAMIN D₃ – CHOLEKALCIFEROL</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Tvorba_D3_ze_7_dehydrocholesterolu_v_kuzi_obratlovcu_vcetne_cloveka_76c2efedb9/Tvorba-D3-ze-7-dehydrocholesterolu-v-kuzi-obratlovcu-vcetne-cloveka.png" alt="Tvorba D3 ze 7-dehydrocholesterolu v kůži obratlovců včetně člověka."/>
<h3>Kalibrace</h3>
Kalibrováno na <a href="https://lcms.cz/products/136">ClinCal® Calibrator RECIPE</a> (0 – 197 nmol/l/D₃ , r² = 0.9964, 0 – 196 nmol/l/D₂, r² = 0.9954 kontrolováno pomocí ClinChek® - Control (serum, Level I s cílovou hodnotou 35.5 nmol/l, bias 11% pro D₂ , s cílovou hodnotou 37.1 nmol/l, bias 9.4% pro D₃ , Level II s cílovou hodnotou 103.0 nmol/l, bias 6.3% pro D₂ , s cílovou hodnotou 105.0 nmol/l, bias 4.6 % pro D₃ ).
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Kalibrace_na_Clin_Cal_Calibrator_RECIPE_a16b9dc858/Kalibrace-na-ClinCal(r)-Calibrator-RECIPE.png" alt="Kalibrace na ClinCal® Calibrator RECIPE"/>
<h3>Preanalytická fáze</h3>
<h5>Odběr vzorků DBS CAPITAINER (Sweden):</h5>
Kapka kapilární krve z prstu dobrovolníka byla aplikována na startovací pozici speciální odběrové soupravy fy Capitainer (Quantitative blood sampling card Capitainer B, The quantitative DBS system) zkoncentrována na produktový disk, který byl použit k vlastní analýze.
<h3>Analytická metodika</h3>
<h5>1. Počáteční příprava analytického vzorku:</h5>
K extrakci z disku DBS byl použit roztok RECIPE Precipitant P/IS (d6-25-OH-D₃, parent iont 389.368 m/z) o objemu 200µl vortex 90 minut, centrifugace 15000 ot/min po dobu 5 minut, 10 minut inkubace při 4°C, opět centrifugace při stejných podmínek jako v prvé a nástřik 50 µl výsledného supernatantu přímo na systém UHPLC/HRMS. Na základě studia výtěžnosti byl čas vortexování ustálen až na 6 hodinách, objem P/IS 400 µl, poté následovala již jen centrifugace za stejných podmínek bez inkubace.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Odber_a_priprava_analytickeho_vzorku_DBS_CAPITAINER_a_RECIPE_1_fe84bdc833/Odber-a-priprava-analytickeho-vzorku-DBS-CAPITAINER-a-RECIPE-1.jpg" alt="Odběr a příprava analytického vzorku DBS CAPITAINER a RECIPE"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Odber_a_priprava_analytickeho_vzorku_DBS_CAPITAINER_a_RECIPE_2_ad9a6e3dff/Odber-a-priprava-analytickeho-vzorku-DBS-CAPITAINER-a-RECIPE-2.jpg" alt="Odběr a příprava analytického vzorku DBS CAPITAINER a RECIPE"/>
<h5>2. Počáteční příprava analytického vzorku</h5>
Celý proces byl také zkoušen na systému 10539735 fy Whatman. Terčíky určené pro novorozenecký screening (filtrační papír s vyšším obsahem celulózy). Poněvadž se jedná o mnohem tenčí sací vrstvu může být doba vortexování oproti systému fy Capitainer zkrácena na dobu maximálně 3 hodin, doba 2 hodin již postačí.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Odber_a_priprava_analytickeho_vzorku_Whatman_e87a691265/Odber-a-priprava-analytickeho-vzorku-Whatman.jpg" alt="Odběr a příprava analytického vzorku Whatman"/>
<h5>3. UHPLC/HRMS</h5>
Systém Q EXACTIVE FOCUS (Thermo Fisher Scientific) v režimu plného skenu (full scan) Optimalizován v režimu Tune na MS7014 RECIPE® Optimisation Mix (parentní ionty: 395.325 - D₂, 383.331 - D₃). 
UHPLC Ultima 3000, kolona LUNA® Omega, 1.6µm Polar C18, 50 x 2.1mm.
<h3>Výsledky</h3>
Ve vzorcích DBS u první skupiny 8 dobrovolníků stanoven D₃ v rozsahu hodnot 22.56 – 93.56 nmol/l bez přepočtu na hematokrit D₂ v těchto vzorkách detekován nebyl. Po optimalizaci doby třepání ad1. byla pro ověření na reálném vzorku DBS testována krev dobrovolnice s již podstatně vyšší hodnotou (62.57 nmol/l) a dále měřeny další DBS. Druhá skupina 7 dobrovolníků porovnány hodnoty v séru vs. DBS.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/RECIPE_Clin_Chek_Serum_Control_Level_I_mean_value_14_7_14_9_mg_L_a_Venozni_krev_muz_roc_1993_d32f615d10/RECIPE-ClinChek(r)-Serum-Control-Level-I-(mean-value-147-14.9-mg-L)-a-Venozni-krev-muz-roc.-1993.png" alt="RECIPE ClinChek® - Serum Control, Level I (mean value 14,7-14.9 μg-L) a Venózní krev, muž, roč. 1993"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Vysledky_analyzy_vzorku_DBS_u_prvni_skupiny_8_dobrovolniku_47d4170b5b/Vysledky-analyzy-vzorku-DBS-u-prvni-skupiny-8-dobrovolniku.png" alt="Výsledky analýzy vzorků DBS u první skupiny 8 dobrovolníků"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Porovnani_hodnoty_v_seru_vs_DBS_skupiny_7_dobrovolniku_5aa2745fcd/Porovnani-hodnoty-v-seru-vs.-DBS-skupiny-7-dobrovolniku.png" alt="Porovnání hodnoty v séru vs. DBS skupiny 7 dobrovolníků"/>
<h3>Diskuze a závěr</h3>
Za optimální hladiny vitamínu D₂/D₃ jsou četnými odborníky považovány hladiny v plasmě/séru kolem 100 nmol/l a vyšší. Avšak v evropské populaci včetně naší jsou nalézány hodnoty bohužel běžně nižší než 50 nmol/l. 
Poznatky z prvé fáze vývoje metody byly úspěšně využity v nyní probíhající validační fázi, která zahrnovala přípravu 50 µl aliquotů rekonstituovaných kalibrátorů a kontrol hlubokým zmrazením na -70 °C a jejich postupné proměřování v DBS režimu Capitainer a Whatman Validace DBS kalibrací bez nutnosti stanovení konvergenčního faktoru (kapalné vzorky v. DBS/kapilární krev v. krev venózní) z prvé fáze vývoje metody bude nutným předpokladem použití metody v rutinním režimu monitorování DBS vzorků širší populace zejména v rámci. 
Nevýhoda Whatman terčíků oproti Capitainer diskům - větší poloměr, nutnost celý terčík rozštípat speciálními štípacími kleštěmi na poměrně velký počet malých dílčích terčíků → prodloužení doby centrifugace a celkové doby zpracování vzorku před extrakcí. Nízké nálezy D₂ jdou evidentně na konto kvality nutrice dobrovolníků/pacientů (i když prozatím statisticky nevýznamný počet), viz přirozené zdroje D₂/D₃.

Adaptace metody RECIPE® 25-OH-VITAMIN D2/D3 in plasma and serum – ON LINE analysis pro vzorky suché krevní skvrny (DBS)

Vliv stravy na antioxidační aktivitu lidské moče

Včela medonosná (Apis mellifera L.) je hospodářsky velmi využívána, a to především za účelem opylování rostlin a zisku včelích produktů. Současný nárůst mortality včelstev vzbuzuje pozornost i u široké veřejnosti. Včely přitom nejsou ohroženy pouze zjevnými faktory, jako jsou nemoci (např. varoáza, akarapidóza, virus deformovaných křídel, mor včelího plodu) a škůdci (např. zavíječ voskový, včelomorka obecná). Důležitou roli zde sehrává i rozsáhlá urbanizace a industrializace. Včasná identifikace faktorů vedoucích k jejich úmrtí umožňuje rychlejší dekontaminace prostředí a s tím spojenou záchranu dalších živočichů či zábranu šíření znečištěných včelích produktů mezi obyvatelstvo.
Pesticidy ze skupiny organofosfátů a karbamátů patří mezi tzv. blokátory acetylcholinesterázy (AChE). AChE slouží k rozkladu neurotransmiteru acetylcholinu (ACh), kdy je vazebné místo AChE acetylováno za vzniku volného cholinu a následně hydrolyzováno za vzniku kyseliny octové. Při reakci enzymu s organofosfáty a karbamáty však dochází k tvorbě mnohem stabilnějšího, obtížně hydrolyzovatelného produktu, což vede k akumulaci ACh v synaptické štěrbině. Ta způsobuje vysokou a dlouhodobou stimulaci nervových buněk vedoucí k třesu, křečím, hyperaktivitě, ztrátě koordinace, paralýze a smrti.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/RADANAL_Vzorky_mrtvych_tel_vcel_pro_analyzu_pesticidu_b11cc3e536/RADANAL-Vzorky-mrtvych-tel-vcel-pro-analyzu-pesticidu.jpg" alt="RADANAL: Vzorky mrtvých těl včel pro analýzu pesticidů"/>
Představujeme analytickou metodu pro monitorování organofosfátů na bázi UPLC-MS/MS. Acefát, dimethoát, diazinon, chlorfenvinfos, chlorpyriphos byly chromatograficky odděleny pomocí chromatografické kolony Ascentis Expres C18 (5 cm x 2,1 mm, 2μm, Supelco Analytical) s předkolonou Ascentis® Expres C18 (0,5 cm x 2,1 mm, 2 μm, Supelco Analytical) a gradientovou elucí mobilních fází vodného roztoku mravenčanu amonného a roztoku mravenčanu amonného v acetonitrilu. Pro hmotnostní spektrometrickou detekci ionizace elektrosprejem a byl použit režim selektivního monitorování reakce (SRM). Jednotlivé kroky vyvinuté metody byly optimalizovány. Všechno data byla statisticky vyhodnocena.
<h3>PŘÍPRAVA VZORKU - QUEChERS metoda</h3>
<ul>
<li>Rozdrcení mrtvého těla včely</li>
<li>Přidání extrakčního činidla acetonitril:hexan (7:2)</li>
<li>Třepání - 6 minut, 600 ot./min</li>
<li>Vysolení - přidání pufrovacíchsolí: (200 mg MgSO₄, 50 mg NaCl, 25 mg C₆H₆Na₂O₇•1,5 H₂O, 50 mg C₆H₅Na₃O₇•2 H₂O)</li>
<li>Třepání - 5 minut, 600 ot./min</li>
<li>Odstředění - 5 minut, 10 000 ot./min</li>
<li>Odebrání vrstvy acetonitrilu nad sedimentem biologické matrice</li>
<li>Přidání 60 mg sorbentu C18/PSA k vrstvě acetonitrilu</li>
<li>Třepání - 2 minut, 600 ot./min</li>
<li>Odstředění - 5 minut, 11 000 ot./min</li>
<li>Supernatantová filtrace - nylon, 0,22 μm</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/RADANAL_Priprava_vzorku_vcel_pro_analyzu_pesticidu_pomoci_LCMSMS_QUE_Ch_ERS_metoda_aa2f7264ce/RADANAL-Priprava-vzorku-vcel-pro-analyzu-pesticidu-pomoci-LCMSMS-QUEChERS-metoda.jpg" alt="RADANAL: Příprava vzorků včel pro analýzu pesticidů pomocí LC/MS/MS - QUEChERS metoda"/>
<h3>UPLC-MS/MS</h3>
Vysokoúčinný kapalinový chromatograf <a href="https://lcms.cz/library?search=ultimate%203000&amp;mainauthorItems=3&amp;instrumentationItems=27">UltiMate 3000 Binary RSLC</a> ve spojení s hmotnostním spektrometrem s trojitým kvadrupólem <a href="https://lcms.cz/library?search=quantum%20access%20max&amp;mainauthorItems=3&amp;instrumentationItems=31-32-35">TSQ Quantum Access Max</a>, vybaveného ionizací elektrosprejem H-ESI (Thermo Fisher Scientific, USA) 
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/RADANAL_Chromatograficky_zaznam_8848cbaeb2/RADANAL-Chromatograficky-zaznam.jpg" alt="RADANAL: Chromatografický záznam"/>
Kolona: Ascentis Expres C18 (5 cm x 2,1 mm, 2 μm, Supelco Analytical) s ochrannou kolonou Ascentis® Expres C18 (0,5 cm x 2,1 mm, 2 μm, analytické Supelco) 
Mobilní fáze A: 25 µM vodný roztok mravenčanu amonného 
Mobilní fáze B: 25 µM roztok mravenčanu amonného v acetonitrilu 
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/RADANAL_Hmotnostni_spektrum_Diazinon_150b7d0002/RADANAL-Hmotnostni-spektrum-Diazinon.jpg" alt="RADANAL: Hmotnostní spektrum Diazinon"/>
<h5>Parametry MS:</h5>
<ul>
<li>Doba cyklu: 0,5 s </li>
<li>Tlak kolizního plynu: 1,5 mTorr Teplota kapiláry: 325 ° C </li>
<li>Teplota odpařovací jednotky: 300 ° C </li>
<li>Tlak sušícího plynu: 45 arb unites </li>
<li>Tlak čistícího plynu: 2 arb unites</li>
<li>Hodnota sprejového napětí: 3300 V</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/RADANAL_Tabulka_vysledku_analyzy_pesticidu_vzorku_vcel_pomoci_UPLC_MSMS_84878db14b/RADANAL-Tabulka-vysledku-analyzy-pesticidu-vzorku-vcel-pomoci-UPLC-MSMS.jpg" alt="RADANAL: Tabulka výsledků analýzy pesticidů vzorků včel pomocí UPLC-MS/MS"/>

Využití LC-MS pro ochranu opylovačů

<h3>ÚVOD</h3>
Třešně a višně jsou tradičně považovány za bohatý zdroj biologicky aktivních látek, jako jsou antokyany, vitamíny či karotenoidy, s pozitivním vlivem na lidské zdraví. Cílem naším práce bylo vyvinout a zavést analytickou metodu, která by umožnovala hodnotit obsah bioaktivních látek u třešní z Portugalska a České republiky. K tomu jsme využili spojení kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí, kterou předcházela na jednoduchá příprava vzorků.
<h3>ANALÝZA TŘEŠNÍ UHPLC-MS/MS</h3>
V první fázi byl použit systém <a href="https://lcms.cz/library?search=ltq+xl&amp;mainauthorItems=3&amp;instrumentationItems=30-31-33-32">lineární iontové pasti LTQ XL</a> ve spojení s pumpou <a href="https://lcms.cz/library?search=Ultimate+3000&amp;mainauthorItems=3">Ultimate 3000</a> pro zjištění profilu fenolických, případně zajímavých flavonoidních látek s antioxidační aktivitou. V návaznosti na provedené profilování byly dále stanoveny vybrané látky.
Pro stanovení těchto antioxidantů v plodech třešní byl použit systém sestavený z ultraúčinného kapalinového chromatografu (UltiMate 3000 Binary RSLC) a tandemového hmotnostního spektrometru s trojitým kvadrupólem (<a href="https://lcms.cz/library?search=tsq+quantum+access+max&amp;mainauthorItems=3&amp;instrumentationItems=31-32-35">TSQ Quantum Access Max</a>) vybaveného ionizací elektrosprejem (H-ESI). Pro chromatografickou separaci byla použita kolona Hypersil GOLD, 50 x 2,1 mm, 1,9 μm (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) s univerzální předklonkou při teplotě 30 °C. Byla použita gradientová eluce. Průtok mobilní fáze byl 0,3 ml/min a nástřikový objem byl 10 µl. Mobilní fáze A obsahovala 0,1 obj. % mravenčí kyseliny ve vodě, mobilní fáze B obsahovala 0,1 obj. % mravenčí kyseliny v methanolu. 
Úprava vzorků byla následující: z homogenizovaných vzorků třešní byl zpracován extrakt s 5 ml 100% methanolu s přídavkem 2 obj. % kyseliny mravenčí.
<h3>VÝSLEDKY</h3>
Na Obr. 2 jsou prezentovány přehlednou formou dosažené výsledky. V třešňových plodech bylo zjištěno významné množství flavonoidu rutinu, který příznivě ovlivňuje složení cévní stěny a její pružnost. Kvercetin byl detekován jen stopově, což je odrazem míry stability rutinu v plodech po sklizni. 
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Radanal_Obr_2_Graficke_porovnani_celkoveho_mnozstvi_dominantnich_antioxidantu_ve_vzorcich_tresni_z_Holovous_sklizen_r_2017_3e6eb58e77/Radanal-Obr.-2-Graficke-porovnani-celkoveho-mnozstvi-dominantnich-antioxidantu-ve-vzorcich-tresni-z-Holovous-sklizen-r.-2017.png" alt="Radanal: Obr. 2: Grafické porovnání celkového množství dominantních antioxidantů ve vzorcích třešní z Holovous , sklizeň r. 2017"/>
Amygdalin, Obr. 3, byl zjištěn s většími množstevními výkyvy, neboť tato látka je lokalizována především v semenech (jádrech pecek). Jeho výsledná množství jsou odrazem difúze přes osemení do dužniny plodu. 
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Radanal_Obr_3_Hmotnostni_spektrum_amygdalinu_s_vyznacenymi_hodnotami_m_z_nejdulezitejsich_produktovych_iontu_aa9a11c8dc/Radanal-Obr.3-Hmotnostni-spektrum-amygdalinu-s-vyznacenymi-hodnotami-m-z-nejdulezitejsich-produktovych-iontu.png" alt="Radanal: Obr.3 : Hmotnostní spektrum amygdalinu s vyznačenými hodnotami m-z nejdůležitějších produktových iontů"/>
Kyselina syringová, Obr.1, v odborné literatuře často uváděná jako typická organická kyselina vyskytující se v plodech třešní, byla nalezena ve výrazně nižším množství než výše popsané antioxidanty. V poměru epikatechin/katechin byl shledán výrazně vyšší podíl epikatechinu. Chlorogenová kyselina byla zaznamenána v podstatně nižších množstvích, kyselina ferulová pak prakticky jen stopově. 
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Radanal_Obr_1_Pseudochromatogram_kyseliny_syringove_d11e8c5572/Radanal-Obr.1-Pseudochromatogram-kyseliny-syringove.png" alt="Radanal: Obr.1: Pseudochromatogram kyseliny syringové"/>

Využití LC-MS/MS systémů ve fytochemickém výzkumu plodů třešní

<h3>Klíčová slova</h3>
CoulArray, FIA, antioxidanty, elektrochemická detekce, třešně, rybízy, angrešty, ekologický režim, integrovaný režim ochrany
<h3>Úvod</h3>
Tato metoda umožňuje objektivní vyhodnocení rozdílů v obsahu antioxidantů mezi odrůdami třešní a drobného ovoce. Také je možné hodnotit, jaký vliv má na celkovou antioxidační aktivitu ovoce režim jeho pěstování. Stejné odrůdy byly pěstovány ve dvou odlišných režimech v ekologickém (ECO) a v režimu s chemickou ochranou (IPM).
<h3>Analýza drobného ovocí pomocí FIA/ECD</h3>
Pro vyhodnocení bioaktivních látek v ovoci ( angrešty a třešně) byla použita FIA Flow Injection Analysis ve spojení s vícekanálovým elektrochemickým detektorem CoulArray při které jsou kvantifikovány elektroaktivní látky na základě přeneseného náboje při různých potenciálech na pracovních elektrodách. Na celách byly aplikovány potenciály 200 400 600 a 800 mV oproti referentní suché hydrogen palladiové elektrodě. Spojení FIA s elektrochemickou detekcí představuje velmi rychlou 66 sekund), levnou a automatizovanou metodu screeningu pro srovnání antioxidační aktivity v různých ovocných odrůdách. Bylo také provedeno srovnání celkové antioxidační aktivity u různých odrůd ovoce pěstovaných v ECO režimu a v rámci IPM.
<h3>Výsledky</h3>
Nejvyšší antioxidační aktivita byla pozorována u černého rybízu, poté u červeného rybízu a třešní. Nejvyšší antioxidační aktivitu vykazovala odrůda černého rybízu OMETA, odrůda červeného rybízu JOHNLEER VAN TETS a odrůda třešní SKEENA. Nejnižší antioxidační aktivita byla zjištěna u bílých angreštů u odrůdy MUCURINES Celková antioxidační aktivita byla vyšší u genotypů s tmavými plody.
U třešní a drobného ovoce byla rovněž porovnána celková antioxidační aktivita vzorků pěstovaných v rozdílných režimech ochrany. Vyšší celkovou antioxidační aktivitu vykazovaly odrůdy pěstované v ekologickém režimu, a to u 83 vzorků angreštů,72 vzorků třešní a u 58 vzorků rybízu. Z toho je patrný vliv pěstebního režimu na antioxidační aktivitu v ovoci, a to v případě třešní a angreštů.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obrazek_1_Porovnani_celkove_antioxidacni_aktivity_tresni_pestovanych_ve_2_ruznych_rezimech_pomoci_metody_FIA_ECD_2b96d1072a/Obrazek-1-Porovnani-celkove-antioxidacni-aktivity-tresni-pestovanych-ve-2-ruznych-rezimech-pomoci-metody-FIA-ECD.jpg" alt="Obrázek 1: Porovnání celkové antioxidační aktivity třešní pěstovaných ve 2 různých režimech pomocí metody FIA/ECD"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obrazek_2_Porovnani_celkove_antioxidacni_aktivity_rybizu_pestovanych_ve_2_ruznych_rezimech_pomoci_metody_FIA_ECD_c2a72a2c3c/Obrazek-2-Porovnani-celkove-antioxidacni-aktivity-rybizu-pestovanych-ve-2-ruznych-rezimech-pomoci-metody-FIA-ECD.jpg" alt="Obrázek 2: Porovnání celkové antioxidační aktivity rybízů pěstovaných ve 2 různých režimech pomocí metody FIA/ECD"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obrazek_3_Porovnani_celkove_antioxidacni_aktivity_angrestu_pestovanych_ve_2_ruznych_rezimech_pomoci_metody_FIA_ECD_a7c1a64f02/Obrazek-3-Porovnani-celkove-antioxidacni-aktivity-angrestu-pestovanych-ve-2-ruznych-rezimech-pomoci-metody-FIA-ECD.jpg" alt="Obrázek 3: Porovnání celkové antioxidační aktivity angreštů pěstovaných ve 2 různých režimech pomocí metody FIA/ECD"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obrazek_4_Graficke_srovnani_vzdy_3_odrud_s_nejnizsi_antioxidacni_aktivitou_reprezentujici_angresty_rybizy_a_tresne_fabddc15af/Obrazek-4-Graficke-srovnani-vzdy-3-odrud-s-nejnizsi-antioxidacni-aktivitou-reprezentujici-angresty-rybizy-a-tresne.jpg" alt="Obrázek 4: Grafické srovnání vždy 3 odrůd s nejnižší antioxidační aktivitou reprezentující angrešty, rybízy a třešně"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obrazek_5_Graficke_srovnani_vzdy_3_odrud_s_nejvyssi_antioxidacni_aktivitou_reprezentujici_angresty_rybizy_a_tresne_8ba6e56878/Obrazek-5-Graficke-srovnani-vzdy-3-odrud-s-nejvyssi-antioxidacni-aktivitou-reprezentujici-angresty-rybizy-a-tresne.jpg" alt="Obrázek 5: Grafické srovnání vždy 3 odrůd s nejvyšší antioxidační aktivitou reprezentující angrešty, rybízy a třešně"/>

Využití metody FIA/ECD pro stanovení celkové antioxidační aktivity drobného ovoce

Kapalinová chromatografie (HPLC) je technika, která hraje klíčovou roli v mnoha oblastech vědy. Je standardně používaná ke kontrole kvality léčiv a biologických látek, ve výzkumu a lékařství [1]. V posledních několika desetiletích se vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) stala pro tyto vědní obory analytickou metodou první volby. Typické HPLC systémy pracují s tlakem do 6000 psi [2] s tím, že běžně využívají chromatografické kolony plněné částicemi s průměrem 3 - 5 μm. Ačkoli kolony s menšími částicemi umožňují rychlejší separace, je jejich použití v HPLC je omezeno na kratší délky kvůli zvýšeným pracovním tlakům [3]. Kromě toho zavedené a validované metody mohou omezovat změny velikosti částic nebo konfigurace kolony.<blockquote><h5>Pozvánka: Waters seminář VIZE 2024</h5>Termín: 19. listopad 2024 (09:00-14:00) Místo: Hotel International Brno<ul><li>REGISTRACE - prezenčně (kapacita naplněna)</li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://web.cvent.com/event/3777ca3f-54bd-4254-b60f-d983bdd58aea/regProcessStep1" data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://web.cvent.com/event/3777ca3f-54bd-4254-b60f-d983bdd58aea/regProcessStep1&amp;source=gmail&amp;ust=1728056346389000&amp;usg=AOvVaw1xlITHjMheUaRl7YUtK2KD">REGISTRACE - on-line stream</a></li></ul></blockquote>Lepší účinnosti <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=48&amp;distributorItems=50">HPLC kolony</a> lze dosáhnout použitím částic s pevným jádrem. Částice s pevným jádrem mají neporézní „pevné“ jádro a porézní vnější vrstvu [4]. Kolony plněné částicemi s pevným jádrem nabízejí zřetelnou výhody oproti těm, které jsou plněny plně porézními částicemi, zejména vyšší účinností a nižším provozním tlakem. Společnost Waters nabízí řadu kolon plněných částicemi s pevným jádrem známou jako k<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=5&amp;search=CORTECS">olony CORTECSTM</a>.&nbsp;Použitím kolon CORTECSTM může být dosaženo jak zvýšení účinnosti separace, tak i zvýšešní rychlosti analýz či snížení objemu rozpouštědel při snížení tlaku v systému oproti konfiguracím s využívající konvenční pórezní častice. &nbsp;V tomto posteru se zabýváme využitím kolon s pevným jádrem z hlediska škálovatelnosti. Porovnávány jsou kolony plněné 5 μm CORTECSTM Prototype Material, CORTECS UPLCTM (1.6μm) a CORTECS HPLC (2,7 μm) C18 Material s kolonami plněnými plně porézními částicemi. Navíc, jsou zde porovnány kolony CORTECS s podobnými komerčními produkty.<h3>Metody</h3><h4>STUDIE 1: TLAK SYSTÉMU A ÚČINNOST&nbsp;</h4><ul><li>LC Systems: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/199">ACQUITY UPLC I-Class System </a>with TUV Detector</li><li>Columns:<ul><li>1.6 μm CORTECS UPLC C18 Column</li><li>2.7 μm CORTECS HPLC C18 Column</li><li>5 μm CORTECS C18 Prototype Column</li><li>1.7 μm ACQUITY BEH C18 Column</li><li>3.5 μm XBridge BEH C18 Column</li></ul></li><li>Flow Rate(s): 0.04 to 1.40 mL/min</li><li>Mobile Phase: Acetonitrile: Water (75:25, v/v)</li><li>Injection Volume: 0.4 μL</li><li>Sample Mixes (μg/mL):&nbsp; thiourea (0.01), naphthalene (0.05), acenaphthene (0.20)</li></ul><h4>STUDIE 2: ŠKÁLOVATELNOST</h4><ul><li>LC Systems: <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=37&amp;distributorItems=50&amp;search=ACQUITY">ACQUITY UPLC System</a> with TUV Detector</li><li>Columns:<ul><li>1.6 μm CORTECS UPLC C18 Column</li><li>2.7 μm CORTECS HPLC C18 Column</li><li>5 μm CORTECS C18 Prototype Column</li><li>Vendor H Columns - 2, 2.7, 5 μm</li><li>Vendor A Columns - &nbsp;1.9, 2.7, 4 μm</li></ul></li><li>Flow Rate(s): 0.25 mL/min</li><li>Mobile Phase: Acetonitrile: 15.4 mM Ammonium Formate pH 3.00 (35:65, v/v)</li><li>Injection Volume: 3.0 μL</li><li>Sample Mixes (μg/mL): uracil (1), pyrenesulfonic acid (6.5), amitriptyline (8), promethazine (3), butylparaben (3.5), naphthalene (20</li></ul>Konfigurace kolon v této studii byla 2.1 x 50 mm přo všechny testované kolony/set-upy. Kolony byly používány při konstatní teplotě 30°C. Analyty byly detekovány pomocí ACQUITY UPLC TUV Detector při 254 nm.<h3>Výsledky a diskuze</h3><h4>STUDIE 1: TLAK SYSTÉMU A ÚČINNOST</h4>Omezené provozní tlaky systému jsou jednou z největších nevýhod HPLC systémů. Obrázek 1 porovnává dosažené provozní tlaky kolon plněných plně porézními částicemi BEH C18 o dvou průměrech s tlaky dosaženými při použití kolon s povrchově porézními částicemi CORTECS C18 se třemi velikostmi částic.&nbsp;<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Waters_Cortecs_columns_Obrazek_1_c0cab3d37c.jpg" alt="Waters: Obrázek 1: Srovnání protitlaku v koloně v závislosti na průtoku u různých kolon a velikostí částic, včetně plně porézních kolon XBridge BEH C18 a kolon CORTECS C18 s pevným jádrem." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Waters_Cortecs_columns_Obrazek_1_c0cab3d37c.jpg 245w," sizes="100vw" width="1317" height="815">Kolony s menší velikostí částic, jako je ACQUITY BEH C18 (průměr částic 1,7 μm) či CORTECS C18 (1,6 μm ) mohou dosahovat daleko vyšších provozních tlaků, než za jakých je možné provozovat klasické HPLC systémy. Kolona CORTECS C18 (2.7 μm) v kratších délkách pak běžně dosahuje tlaků klasické HPLC, tj. do 6000. Naopak při použití delších kolon, může být tento HPLC limit překročen.HPLC metody, které využívají kolony s plně pórezními částicemi 3.5 μm, dosahují tlaku přibližně 2500 psi průtoku 1.4 ml/min, což je nižší tlak ve srovnání s kolonou CORTECS C18 s částicemi 2.7 μm. Naopak kolona CORTECS C18 (5μm) Prototype pracuje při ještě nižším tlaku (cca 1800 psi), což je o 28 % méně než u kolony XBridge C18 BEH 3,5 μm. Tento výrazný pokles tlaku zajišťuje dlouhou životnost HPLC systému (zjeména pak čerpadla, ventily a kapiláry) bez snížení účinnosti systému.&nbsp;<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Waters_Cortecs_columns_Obrazek_2_c10d6da1f4.jpg" alt="Waters: Obrázek 2: Srovnání účinnosti kolony v závislosti na průtoku pro 3,5 μm kolonu XBridge BEH C18 a 5 μm prototypovou kolonu CORTECS 18." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Waters_Cortecs_columns_Obrazek_2_c10d6da1f4.jpg 245w," sizes="100vw" width="1336" height="816">Účinnost kolony, obvykle vyjádřená jako počet teoretických pater (N), vyjadřuje schopnost kolony generovat úzké píky. Čím účinnější kolona je, tím užší píky generuje. Obrázek 2 znázorňuje graf porovnávající účinnost kolony v závislosti na průtoku pro dvě různé kolony: CORTECS C18 Prototype (5 µm) a kolony XBridge BEH C18 (3.5 μm). Zajímavé je, že 5 µm kolona CORTECS C18 Prototype, navzdory většímu objemu vykazuje optimální účinnost, která je o 14 % vyšší než u kolony 3,5 um XBridge BEH C18 Column. Proto 5 µm kolona CORTECS C18 Prototype překonává v účinnosti kolonu 3.5 um XBridge BEH C18.<h4>STUDIE 2: ŠKÁLOVATELNOST</h4>Šest různých vzorků bylo analyzováno ze použití mobilní fáze ve složení acetonitril: 15.4 mM mravenčan amonný (35:65) při průtoku 0.25 ml/min. Kolony CORTECS a CORTECS Prototype Columns o různých velikostí částic byly testovány za stejných podmínek. Tři kolony plněné částicemi s pevným jádrem o různých velikostech částic od dvou různých komerčních dodavatelů byly rovněž testovány za stejných podmínek, jak je znázorněno na obrázku 3.Škálovatelnost je pro uživatele HPLC zásadní z několika důvodů. Například metody vyvinuté na kolonách s menší velikostí částic (např. sub-2 μm) jsou často optimalizovány pro dosažení vysoké rychlosti či účinnosti. Tyto kolony však nejsou vždy vhodné pro rutinní měření kvality (QC) kvůli vyšším provozním tlakům. Proto je nutné zajistit, aby kolony byly škálovatelné napříč velikostmi částic a mohly být využívány pro QC.&nbsp;<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Waters_Cortecs_columns_Obrazek_3_be51a695c7.jpg" alt="Waters: Obrázek 3: Chromatogramy kolon CORTECS C18 s různou velikostí částic ve srovnání s kolonami prodejce H a prodejce A. 1) uracil 2) kyselina pyrenesulfonová 3) promethazin 4) amitriptylin 5) butylparaben 6) naftalen." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Waters_Cortecs_columns_Obrazek_3_be51a695c7.jpg 245w," sizes="100vw" width="1266" height="773">Obrázek 3 zdůrazňuje důležitost škálovatelnosti podle velikosti částic. Kolony CORTECS jsou škálovatelné, protože retenční časy jsou podobné u všech tří velikostí částic. Oproti tomu je z tohoto srovnání patrné, že kolony komerční produkt výrobců H a A však neposkytují stejnou škálovatelnost, protože retenční časy jsou u kolon s větší velikostí částic (5 a 4 µm) výrazně posunuty. U výrobců H a A mohou být nižší retenční časy u kolon s větší velikostí částic způsobeny rozdíly, jako je nestejná hodnota rho u různých velikostí částic, resp. poměru průměrem pevného jádra a průměrem celé částice). Hodnota rho má významný vliv na retenci, a tím i na škálovatelnost, protože čím více se hodnota rho blíží 1, tím více se vnější vrstva porézního materiálu se stává tenčí, což vede k menšímu povrchu, a tím i k nižší retenci. Kolony CORTECS a prototypové kolony CORTECS o průměru 5 μm byly vyvinuty tak, aby splňovaly požadavky uživatelů HPLC, kteří hledají produkt, který nejenže snižuje tlak sytému a zlepšuje účinnost, ale také umožňuje škálovatelnost napříč LC systémy.<h3>ZÁVĚR</h3><ul><li>5 μm prototypové sloupce CORTECS mají o 28 % nižší protitlak ve srovnání s prototypy CORTECS 3.5 μm kolony XBridge BEH C18.</li><li>5 μm kolony CORTECS Prototype mají o 14 % vyšší optimální účinnost v porovnání s kolonami 3.5 μm XBridge BEH C18.</li><li>Kolony CORTECS jsou škálovatelné ve všech 3 uvedených velikostech částic.</li><li>Pro srovnání, kolony prodejce H a A nejsou škálovatelné ve všech 3 velikostech částic z důvodu výrazně nižší retence u částic o velikosti 4 a 5 μm, jak je znázorněné na obrázku 3.</li></ul>

Škálovatelnost kolon plněných částicemi s pevným jádrem pro chromatografické analýzy

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Je společnost zabývající se výzkumem a vývojem, prodejem a aplikační podporou chromatografických metod včetně chromatografického spotřebního materiálu. Společnost je organizátorem mezinárodní konference INDC a konference VITATOX.

RADANAL

Firmu Waters založil v roce 1958 pan James Waters. Od té doby se společnost Waters specializuje na kapalinovou chromatografii a hmotnostní spektrometrii. Divize TA Instruments působí na poli termální analýzy. V České republice je Waters zastoupen přímou pobočkou, která sídlí v Praze.

Waters Gesellschaft

Shimadzu at ISC 2026

DataApex at ISC 2026

ISC 2026 - the 35th International Symposium on Chromatography

Modern Methods for Faster Microbial Analysis

Addressing LC Method Optimization - Scaling For Efficiency, Throughput And Reproducibility

Proteoform Studio software, top down made simple

LCMS novinky typu poster - strana 1