LipidQuan: HILIC-based LC-MS/MS High-Throughput Targeted Free Fatty Acid Screen

Význam tématu

Volné mastné kyseliny představují metabolicky aktivní lipidovou třídu, která i přes nízký podíl na celkových lipidových zásobách v plazmě ovlivňuje energetický metabolismus, zánětlivé procesy a signalizaci. Mezi nejběžnější patří kyselina olejová, palmitová a stearová, dohromady tvořící významnou část volných mastných kyselin. Dlouhořetězcové polynenasycené mastné kyseliny jsou klíčové pro syntézu eikosanoidů a dalších bioaktivních mediátorů spojených s řadou onemocnění.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlý a robustní LC-MS/MS screening pro cílenou kvantifikaci 24 volných mastných kyselin v lidské plazmě. Použití HILIC chromatografie na platformě LipidQuan minimalizuje časovou náročnost přípravy vzorku i délku analýzy, snižuje potřebu derivatizace a usnadňuje implementaci metody v rutinním provozu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci mastných kyselin byla použita jednoduchá precipitace proteinů isopropanolem v poměru 1:5 s následným chlazením, centrifugací a přenosem supernatantu do skleněných vialek. Chromatografie probíhala na sloupci BEH Amide v režimu HILIC s gradientem acetonitril/voda s 10 mM octanem amonným. Analýzu provádělo UPLC ACQUITY I-Class spojené s hmotovým spektrometrem Xevo TQ-S micro/XS/S v režimu ESI negativní ionizace a MRM akvizice. K výpočtu kalibrační křivky byly použity stabilně značené standardy SPLASH LIPIDOMIX™.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila separaci volných mastných kyselin jako úzkého chromatografického pásu během přibližně 0,5 minuty v celkovém čase analýzy osmi minut. Dynamický rozsah byl lineární přes čtyři řády koncentrací s typickými hodnotami R2 nad 0,95 a variačními koeficienty CV menšími než 30 %. Ve srovnání s GC-MS vyžadujícím derivatizaci a s RP LC-MS, kde koeluce snižuje spolehlivost identifikace, HILIC přinesla vyšší specifičnost a redukci počtu potřebných standardů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a vysoce propustná analýza volných mastných kyselin v osmi minutách
• Minimalizovaná příprava vzorku bez derivatizace
• Snížené náklady na standardy díky separaci lipidů podle tříd
• Snížení metodologické složitosti a času školení personálu
• Kompatibilita s existujícími softwarovými nástroji TargetLynx a Skyline

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj metodiky lze dále rozšířit o automatizaci přípravy vzorku, integraci do klinické rutiny pro screening biomarkerů a kombinaci s dalšími omickými přístupy. Potenciál představuje i rozšíření pokrytí na další lipidové podtřídy a optimalizace pro minimalizaci spotřeby vzorku.

Závěr

Popsaná HILIC-LC-MS/MS metoda na platformě LipidQuan nabízí efektivní, citlivý a robustní postup pro kvantifikaci volných mastných kyselin v plazmě bez nutnosti složité přípravy vzorku či derivatizace. Umožňuje kvalitní analýzu s širokým dynamickým rozsahem a vysokou propustností vhodnou pro běžné rutinní i výzkumné aplikace.

Reference

• Ran-Ressler RR Bae S Lawrence P Wang DH Branched-Chain Fatty Acid Content of Food and Estimated Intake in the USA British Journal of Nutrition 2014 112 4 565–572
• Ran-Ressler RR Devapatla S Lawrence P Brenna JT Branched Chain Fatty Acids are Constituents of the Normal Healthy Newborn Gastrointestinal Tract Pediatric Research 2008 64 6 605–609
• Quehenberger O Armando AM Brown AH Milne SB Myers DS Merrill AH Dennis EA Lipidomics Reveals a Remarkable Diversity of Lipids in Human Plasma Journal of Lipid Research 2010 51 11 3299–3305
• Brevik A Veierød MB Drevon CA Andersen LF Evaluation of the Odd Fatty Acids 15:0 and 17:0 in Serum and Adipose Tissue as Markers of Intake of Milk and Dairy Fat European Journal of Clinical Nutrition 2005 59 12 1417–1422
• Dennis EA Norris PC Eicosanoid Storm in Infection and Inflammation Nature Reviews Immunology 2015 15 8 511–523
• Cifkova E Holcapek M Lisa M Ovcacikova M Lycka A Lynen F Sandra P Nontargeted Quantitation of Lipid Classes Using Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry with Single Internal Standard and Response Factor Approach Analytical Chemistry 2012 84 22 10064–10070
• Kopf T Schmitz G Analysis of Non-Esterified Fatty Acids in Human Samples by Solid-Phase-Extraction and Gas Chromatography/Mass Spectrometry Journal of Chromatography B 2013 938 22–26