Optimizing Xevo G2-XS QTof Quadrupole Settings to Increase Sensitivity and Dynamic Range for the Analysis of Trastuzumab

Význam tématu

Rozvoj komplexních bioterapeutik vyžaduje vysoce selektivní a citlivé kvantitativní LC-MS metody, které doplňují ligandové testy a poskytují doplňující informace k biologickým analýzám. HRMS techniky nabízejí vysoké hmotnostní rozlišení a širší rozsah pro analýzu intactních proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je ukázat, jak optimalizace vnitrokvadrupólového selekčního okna na Xevo G2-XS QTof s použitím režimu Tof-MRM zvyšuje citlivost, selektivitu a dynamický rozsah při kvantifikaci tryptických peptidů trastuzumabu ve složitých matricích.

Použitá instrumentace

• MS: Xevo G2-XS QTof HRMS se zdrojem ESI+ a režimem Tof-MRM
• LC: ACQUITY UPLC H-Class se sloupcem Peptide BEH C18 (1.7 µm, 2.1 × 100 mm)
• Software: MassLynx v4.1, TargetLynx
• Kalibrace: klastre sodné jodidové kalibrační roztoky
• Přeanalytické sady: Protein A magnetické kuličky, ProteinWorks eXpress Digest Kit, ProteinWorks µElution SPE Clean-up Kit

Použitá metodika

• Příprava vzorku: purifikace trastuzumabu z 50 µL plazmy potkana pomocí Protein A magnetických kuliček, následná tryptická digesce a SPE čištění
• Chromatografie: gradient 5–50 % acetonitrilu v 0.1 % kyselině mravenčí za 8 min, průtok 0.3 mL/min
• MS parametry: sběr dat v rozsahu 200–1500 m/z, selekční okno kvadrupólu nastaveno na 1–4 Da, extrakční okno 50 mDa
• Cílové peptidy a fragmenty: FTISADTSK ([M+2H]2+ 485.2480 → y7 721.3727), DTYIHWVR ([M+2H]2+ 545.2774 → y4 597.3256)

Hlavní výsledky a diskuse

Zúžení selekčního okna z 4 Da na 1 Da významně potlačilo izobarické rušení matrice, čímž se zlepšilo poměr signál/šum z 1.57 na 16.1 pro DTYIHWVR při LLOQ 0.05 µg/mL a z 2.56 na 10.0 pro FTISADTSK při LLOQ 0.025 µg/mL. Dynamický rozsah se rozšířil z 0.025–10 µg/mL na 0.010–10 µg/mL pro FTISADTSK a z 0.050–500 µg/mL na 0.025–500 µg/mL pro DTYIHWVR. Kalibrační křivky vykázaly lineární závislost s r2 > 0.99, což potvrzuje robustnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená selektivita a citlivost v komplexních biologických matricích
• Snížené rušení matrice usnadňuje automatizované zpracování dat
• Rozšířený dynamický rozsah a nižší LLOQ vhodné pro biofarmaceutický výzkum a kontrolu kvality

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření optimalizace selekčního okna kvadrupólu na další bioterapeutika, integrace s imunoafinitními preanalytikami a plně automatizovanými workflow, využití pokročilé analýzy dat a umělé inteligence pro další zvýšení výkonu metod.

Závěr

Optimalizace šířky selekčního okna kvadrupólu se ukázala jako efektivní přístup ke zvýšení citlivosti, selektivity a dynamického rozsahu kvantitativních LC-MS analýz peptidů ve složitých matricích.

Reference

1. Li F Fast D Michael S Absolute quantitation of protein therapeutics in biological matrices by enzymatic digestion and LC-MS Bioanalysis 2011 3(21)2459–2480
2. Olah TV Quantitation of therapeutic proteins following direct trypsin digestion of dried blood spot samples and detection by LC-MS based bioanalytical methods in drug discovery Bioanalysis 2012 4(1)29–40
3. Lame M Dunning C Alelyunas Y Wrona M Comparison of tandem and high resolution mass spectrometry for the quantification of the monoclonal antibody trastuzumab in plasma Waters Corporation 720006207EN 2018
4. Promega Corporation Product information for Magne Protein A beads 2018