AUTOMATED HIGH-THROUGHPUT FLUX ANALYSIS OF NON-SMALL CELL LUNG CARCINOMA CELLS GROWN IN VITRO IN TWO AND THREE DIMENSIONS

Význam tématu

Analýza metabolických toků v buněčných kulturách je klíčová pro pochopení biochemických adaptací nádorových buněk. Tradiční monovrstvové (2D) kultury neplně vystihují komplexitu in vivo mikroprostředí. Trojrozměrné (3D) sféry lépe reprezentují fyziologické podmínky a mohou odhalit rozdíly v nutrientní využitelnosti a energetickém metabolismu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat metabolické toky lidských nesmělobuněčných karcinomových buněk pěstovaných jako monovrstvy a jako sféry po 13C značení glukózy. Autoři představili zautomatizované vysokoprůtokové workflow založené na softwarové platformě Symphony spojené s nástroji MSConvert, El-MAVEN a Polly pro zpracování a vizualizaci dat z LC-MS analýz.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky buněk H1299 byly pěstovány jako 2D monovrstvy a 3D sféry za použití pHEMA na Petri miskách. Po inkubaci s [U-13C6]-glukózou následovala extrakce metabolitů studeným metanolem a chloroformem, následné sušení a resuspenze v acetonitrilu. Analýza proběhla na UPLC systému ACQUITY UPLC I-Class s BEH C18 kolonkou při 40 °C a na hmotnostním spektrometru Xevo G2-XS QTof v režimu ESI negativní jonizace. Data byla přenesena na server, převedena pomocí MSConvert do formátu mzXML, detekována a křivkově integrovaná v El-MAVEN a nakonec korigována a vizualizována v prostředí PollyPhi.

Hlavní výsledky a diskuse

Sféry vykazovaly výrazně vyšší frakční obohacení laktátu 13C3 ve srovnání s monovrstvemi, což ukazuje na nárůst glykolytické aktivity. Zároveň byly detekovány vyšší podíly 13C2 isotopologů klíčových metabolitů TCA cyklu, což nasvědčuje posunu glukózového uhlíku skrze pyruvát dehydrogenázu do acetyl-CoA. Rozdílné toky glukózy v 2D a 3D systémech mají zásadní dopad na interpretaci in vitro dat a jejich přenos do in vivo podmínek.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizace workflow umožňuje zpracovat velké množství vzorků v krátkém čase s minimem manuálních zásahů.
• Ucelený software pro převod dat, detekci isotopologů a korekci přirozené abundance zkracuje dobu analýzy a snižuje riziko chyb.
• Metoda poskytuje detailní přehled o změnách v glykolýze a TCA cyklu, což je cenné pro onkologický výzkum a vývoj léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace dalších modulů strojového učení pro automatické rozpoznávání vzorců ve velikých datech metabolomiky. Rozšíření platformy o analýzu lipidomiky a proteomiky. Využití 3D biotisků a organoidů pro ještě realističtější modely nádorového mikroprostředí. Možnost kombinace výsledků s in vivo daty pro lepší překladitelnost výzkumu do klinické praxe.

Závěr

Studie demonstruje, že 3D sféry H1299 buněk výrazně změnily metabolické toky glukózy ve srovnání s 2D monovrstvemi. Automatizované vysokoprůtokové workflow založené na Symphony, MSConvert, El-MAVEN a PollyPhi poskytuje efektivní nástroj pro detailní fluxovou analýzu, podporující přesnější interpretaci experimentálních dat a jejich aplikaci v onkologickém výzkumu.

Reference

1. Li et al. Survival advantages of multicellular spheroids vs. monolayers of HepG2 cells in vitro. Oncol Rep. 2008 Dec;20(6):1465-71.
2. Wallace et al. A Model for Spheroid versus Monolayer Response of SK-N-SH Neuroblastoma Cells to Treatment with 15-Deoxy-PGJ2. Comput Math Methods Med. 2016;2016:3628124.
3. Fernandez et al. The mitochondrial citrate carrier, SLC25A1, drives stemness and therapy resistance in non-small cell lung cancer. Cell Death Differ. 2018 Jul;25(7):1239-1258.