TANDEM QUADRUPOLE MS FOR THE QUANTIFICATION OF MONOCLONAL ANTIBODY SUBUNIT LIGHT CHAINS IN PLASMA

Význam tématu

Tandemová kvadrupólová hmotnostní spektrometrie představuje citlivou a selektivní metodu pro kvantifikaci subjednotek lehkých řetězců monoklonálních protilátek v plazmě. Přímé měření intactních protilátek nebo jejich subjednotek je zásadní pro přesné sledování farmakokinetiky, stability a biotransformací bioterapeutik in vivo.

Cíle a přehled studie

Tato studie se zaměřila na vývoj a optimalizaci workflow pro kvantifikaci lehkých řetězců adalimumabu v potkaní plazmě. Hlavní kroky zahrnovaly imunoafinitní purifikaci, redukci a alkylaci subjednotek, následnou chromatografickou separaci a detekci pomocí LC-MS/MS na tandemovém kvadrupólu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro preparativní část byly využity:

• Imunoafinitní purifikace: biotinylovaný anti-humán Fc protilátka na streptavidinových magnetických kuličkách
• Redukce: dithiothreitol; alkylace: iodoacetamid; neutralizace formiální kyselinou
• Automatizovaný systém ProteinWorks Auto-eXpress pro redukci a alkylaci

Chromatografie a detekce probíhaly na:

• UPLC systém ACQUITY UPLC I-Class PLUS (fixed loop)
• Kolony: BioResolve RP mAb Polyphenyl (450 Å, 2,7 µm, 2,1 × 50 mm) a BEH C4 (300 Å, 1,7 µm, 2,1 × 50 mm) při 80 °C
• Mobilní fáze: 0,1 % formiální kyselina ve vodě (A) a v acetonitrilu (B)
• MS: Xevo TQ-XS tandemový kvadrupól; pro vývoj fragmentů HRMS na Xevo G2-XS

Hlavní výsledky a diskuse

Použití BioResolve sloupce značně zlepšilo tvar a čistotu píků oproti BEH C4, umožňující rychlou separaci adalimumabu a interního standardu (cetuximab). Metoda dosáhla dynamického rozsahu 25–100 000 ng/mL, s přesností QC vzorků 89–112 % a opakovatelností RSD < 6 %. Pro kvantifikaci byl vybrán konzervovaný MS/MS fragment m/z 1329,85 z lehkého řetězce. Srovnání výkonu tandemového kvadrupólu a vysokorozlišovacího MS ukázalo porovnatelné spektrální obálky a spolehlivost při analýze molekul nad 10 kDa.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda vyniká vysokou selektivitou a citlivostí, minimálním objemem vzorku (10 µL plazmy) a krátkým časem analýzy (~8,5 min). Je vhodná pro farmakokinetické studie, monitorování stability bioterapeutik, QA/QC procesy a rutinní klinické aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na multiplexní kvantifikaci více monoklonálních protilátek v jednom běhu, vyšší stupeň automatizace přípravy vzorků a integrace iontové mobility. Kombinace s HRMS a pokročilou datovou analýzou umožní detailnější charakterizaci bioterapeutik a jejich metabolitů.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda na tandemovém kvadrupólu nabízí rychlou, robustní a vysoce citlivou platformu pro kvantifikaci lehkých řetězců monoklonálních protilátek v biologických matricích. Je snadno přenositelná do rutinního provozu a podporuje dlouhodobé farmakokinetické a stabilitní studie.

Reference

• Nguyen JM; Kizekai L; Walsh D; Cook J; Lauber MA. A Novel Phenyl Bonded Phase for Improved Reversed-Phase Separations of Proteins. Waters Application Note 720006169EN, January 2018.
• Dunning CM; Lame M; Wrona M; Haynes K. Tackling Non-Specific Binding of Biotherapeutics Using LC-MS Compatible QuanRecovery Sample Plates with MaxPeak High Performance Surfaces. Waters Application Note 720006528EN, March 2019.