SMALL SCALE NATURAL PRODUCT ISOLATION USING UPLC™ WITH MASS-DIRECTED PURIFICATION™

Význam tématu

Izolace přírodních produktů v malém měřítku je klíčová pro výzkum biologicky aktivních látek z botanických zdrojů. Moderní chromatografické techniky s řízením podle hmotnosti (mass-directed purification) umožňují rychlé a selektivní získání cílových sloučenin při minimální spotřebě vzorku a reagencií. Tato metoda zvyšuje efektivitu přípravy vzorků a snižuje pracovní zatížení laboratoře.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo demonstrovat využití kombinace ultra vysokovýkonné kapalinové chromatografie (UPLC) a hmotnostně řízené frakční izolace pro separaci a isolaci glycyrrhizové kyseliny z extraktu sladkého kořene (Glycyrrhiza glabra). Studie také ukazuje schopnost metody oddělit a analyzovat čtyři blízce elující impurity.

Použitá metodika a instrumentace

Ke studii byly použity tyto přístroje a podmínky:

• ACQUITY UPLC H-Class se vzduchovým detektorem PDA, ACQUITY QDa detektorem a Fraction Manager-Analytical (WFM-A)
• Kolona ACQUITY UPLC BEH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7 μm, 130 Å, 0,5 mL/min, 30 °C
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě; B: 0,1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu nebo v poměru ACN:methanol 3:1
• Gradient 25–70 % B v 5 min pro optimalizaci rozlišení
• MS Scan 100–1250 m/z v ES+ a ES−, QDa detektor, sampling 2 Hz
• UV detekce na 251 nm
• Sběr frakcí řízen rychlým ventilem s nízkou disperzí WFMA

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný gradient a změna složení mobilní fáze významně zlepšily oddělení glycyrrhizové kyseliny od příbuzných impurit. Hmotnostně řízená izolace umožnila selektivní shromažďování úzkých, ostrých píků a eliminaci nežádoucích frakcí ještě během běhu chromatografie. Analýza izolátu prokázala uspokojivou čistotu >95 % a potvrzení identity glycyrrhizové kyseliny na základě monoisotopních iontů [M+H]+, [M+Na]+ a [M−H]−.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlejší izolaci cílových látek s minimálním zpracováním vzorku
• Úsporu vzorku a spotřebního materiálu při nízkých objemech extraktu
• Vyšší selektivitu díky kombinaci UV a MS detekce
• Automatizované řízení frakční izolace zvyšující reprodukovatelnost

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj v oblasti miniaturizace a integrace s automatizovanými pracovním postupy, využití pokročilých stacionárních fází a zelenějších rozpouštědel. Metoda najde uplatnění v farmaceutickém průmyslu, metabolomice, screeningových studích přírodních produktů a kvalitativní kontrole biologicky aktivních směsí.

Závěr

Studie potvrdila, že kombinace UPLC s mass-directed purification představuje efektivní a spolehlivý přístup k izolaci malého množství přírodních produktů s vysokou čistotou. Tento postup zkracuje čas přípravy, minimalizuje potřebu pracovních kroků a usnadňuje získání analyticky čistých látek pro další výzkum.

Reference

1. Tao W et al. Comparison of three officinal Chinese pharmacopoeia species of Glycyrrhiza based on separation and quantification of triterpene saponins and chemometrics analysis. Food Chemistry. 2012;132:2188–2193.
2. de Villiers A et al. Recent advances and trends in the liquid-chromatography-mass spectrometry analysis of flavonoids. Journal of Chromatography A. 2016;1430:16–78.
3. Ganzera M, Sturm S. Recent advances on HPLC/MS in medicinal plant analysis — An update covering 2011–2016. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2018;147:211–233.
4. Thilakarathna SH, Rupasinghe HPV. Flavonoid bioavailability and attempts for bioavailability enhancement. Nutrients. 2013;5:3367–3387.
5. Montoro P et al. Metabolic profiling of roots of liquorice (Glycyrrhiza glabra) from different geographical areas by ESI/MS/MS and determination of major metabolites. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2011;54:535–544.
6. Liao WC et al. Identification of two licorice species, Glycyrrhiza uralensis and Glycyrrhiza glabra, based on separation and identification of their bioactive components. Food Chemistry. 2012;132:2188–2193.
7. Montoro P et al. Metabolic profiling of roots of liquorice (Glycyrrhiza glabra) from different geographical areas by ESI/MS and MS/MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2011;54:535–544.