A rapid screening method of mycotoxins in grains by liquid chromatograph tandem mass spectrometry

Význam tématu

Mykotoxiny jsou toxické látky produkované plísněmi, které mohou kontaminovat obiloviny a ohrozit zdraví lidí i zvířat. Regulace limitů přítomnosti různých druhů mykotoxinů je v praxi klíčová pro potravinářský i krmivářský průmysl. Rychlá a spolehlivá screeningová metoda je proto nezbytná pro efektivní monitorování kvality surovin.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout jednoduchou a rychlou simultánní metodu pro screening 18 vybraných mykotoxinů (aflatoxiny, fumonisiny, ochratoxin A, trichotheceny a další) v obilovinách. Analýza probíhala za použití ultraefektivní kapalné chromatografie (UHPLC) v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS/MS) a komerčními clean-up sloupci MycoSpin™.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byla využita soustava Nexera™ X2 UHPLC se stacionární fází PFP (Mastro PFP 2, 150×2,1 mm, 3 μm). Mobilní fáze A obsahovala 10 mmol/l acetát amonný ve vodě, fáze B methanol s 2 % kyseliny octové. Gradient probíhal v čase 0–15 min, průtok 0,4 ml/min, teplota kolony 40 °C, objem injekce 2,5 μl s předzásobou vody. Hmotnostní spektrometr LCMS-8050 pracoval v režimu ESI pozitivně/negativně s ultra rychlým přepínáním polarity (5 ms) a MRM až 555 přechodů/s. Teploty: rozptýlené plyny 5–15 l/min, interface 200 °C, desolvační zóna 400 °C.

Sample preparation

Vzorky pšeničné a kukuřičné moučky (2,5 g) se extrahovaly 10 ml 50% acetonitril-vody (optimalizováno), třepaly 90 min a centrifugovaly. Supernatant 1 ml se upravil kyselinou octovou, aplikoval na MycoSpin™400 kolonu, vortexoval 1 min, centrifugoval a získal 350 μl vyčištěného extraktu. Celý clean-up trval do 5 min.

Hlavní výsledky a diskuse

MRM chromatogramy standardů (každý 10 ng/ml) prokázaly dobrou separaci 18 analyzovaných mykotoxinů během 15minutového cyklu. Optimalizace extrakčního rozpouštědla ukázala, že 50% acetonitril-voda výrazně zlepšuje návratnost fumonisinů oproti 85% směsi. Po clean-upu však stále dochází k maticovým efektům, které byly vyhodnoceny na pšeničném, kukuřičném, arašídovém a mandlovém extraktu. Pro kompenzaci těchto vlivů byla použita metoda přídavku standardů.
Kvantifikace ve spikovaných vzorcích pšenice a kukuřice (100 ng/příklad) dosáhla průměrných návratností 60–134 %, %RSD <20 % a korelačních koeficientů kalibrací R2 ≥0,997. Metoda splňuje limity EC/1886/2006.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý clean-up (do 5 min) bez odpařování a dusíkových zón.
• Kompletní analýza 18 mykotoxinů včetně fumonisinů, trichothecenů a ochratoxinu A během 15 minut.
• Vysoká citlivost a reprodukovatelnost (RSD pod 20 %).
• Využití standardní přídavkové kalibrace eliminuje vlivy matrice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace clean-up kroků za použití multifunkčních nebo iontově výměnných stacionárních fází pro snížení pozadí matrice.
• Implementace označených interních standardů pro zvýšení přesnosti kvantifikace.
• Automatizace přípravy vzorku ve vysokokapacitních laboratořích.
• Rozšíření metody na další potravinářské matice a komplexní potravinové matrice.

Závěr

Vyvinutá metoda využívající UHPLC-ESI-MS/MS a MycoSpin™ clean-up umožňuje rychlý a spolehlivý screening 18 mykotoxinů v obilovinách. Optimalizace extrakce a kalibrace přídavkem standardů zabezpečuje přesné kvantitativní výsledky v souladu s regulačními požadavky. Další vylepšení slibují sofistikovanější čisticí sloupce a plná automatizace procesu.