Comprehensive analysis of primary & secondary metabolites in citrus using an automated method changeover UHPLC system coupled to LC/MS/MS

Význam tématu

Analýza primárních a sekundárních metabolitů v citrusových plodech umožňuje hodnotit nutriční kvalitu, senzorické vlastnosti i zdravotní přínos těchto plodin. Podpora šlechtění nových odrůd, optimalizace zemědělských postupů a kontrola kvality potravin vyžadují rychlé a komplexní metody pro simultánní stanovení organických kyselin, aminokyselin, cukrů, karotenoidů a flavonoidů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit automatizovaný postup pro současnou separaci a kvantifikaci primárních i sekundárních metabolitů v ovoci a slupce sedmi citrusových odrůd metodou UHPLC s více metodami spřaženými na LC/MS/MS. Zaměřili se na populární mandarinky, grepy a hybridní kultivary, aby ukázali rozdíly v metabolickém profilu mezi plodem a slupkou i mezi jednotlivými odrůdami.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci byly homogenizovány vzorky plodů a slupky, extrahovány vodou/methanolem a organickými rozpouštědly a následně filtrovány a ředěny podle skupiny analytů. Separace probíhala v režimu multi-method na UHPLC Nexera s automatickou výměnou metod zahrnující tři analytické podmínky:

• kolona Discovery HS F5-3 pro organické kyseliny, aminokyseliny a flavonoidy
• kolona Inertsil ODS-4 pro karotenoidy
• kolona Asahipak NH2P-50 2D pro cukry

Detekce byla realizována na kvadrupólovém hmotnostním spektrometru LCMS-8050 v režimu MRM s elektrosprayovou ionizací (ESI) v kladném i záporném módu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila adekvátní rozlišení 10 organických kyselin, 24 aminokyselin, 5 cukrů, 9 karotenoidů a 5 flavonoidů během 40 minut bez nutnosti výměny kolony nebo mobilních fází. Kalibrační křivky pokrývaly rozsahy až od jednotek do desítek tisíc mikrogramů na litr a limity kvantifikace spolehlivě pod úrovní analytického zájmu.
Pomocí PCA byl prokázán jasný rozdíl mezi metabolickým profilem plodu a slupky zejména ve složení cukrů, karotenoidů a flavonoidů. Plody obsahovaly obdobné celkové množství cukrů jako slupky, avšak ve větší míře obsahovaly sacharózu, zatímco slupky měly vyšší podíl glukózy a fruktózy. Naopak slupky vykazovaly až pětinásobně vyšší koncentrace flavonoidů, zatímco plody byly bohatší na karotenoidy, zejména β-karoten a β-kryptoxanthin.
PCA pro ovocné vzorky ukázala, že hybridy mandarinek vykazují výrazně vyšší hladiny karotenoidů než čisté mandarinky.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a komplexní analýza klíčových metabolitů pro potravinářské a šlechtitelské programy.
• Redukce doby analýzy a manuální práce díky automatickému přepínání metod.
• Využití v QA/QC odděleních pro standardizaci kvality citrusových produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace této platformy s nevláknovou extrakcí a online vzorkovači by mohla umožnit vyšší automatizaci a menší spotřebu vzorku. Další vývoj se zaměří na rozšíření spektra metabolitů, včetně fenolických kyselin a glykokonjugátů, a na implementaci machine learningu pro pokročilou datovou analýzu a predikci odrůdových vlastností.

Závěr

Vyvinutá UHPLC–LC/MS/MS metoda s automatizovaným přepínáním metod poskytuje spolehlivou, rychlou a vysoce výkonnou platformu pro komplexní metabolomickou analýzu citrusů. Umožňuje detailní hodnocení rozdílů mezi plodem a slupkou a mezi jednotlivými odrůdami, což podporuje šlechtění, kontrolu kvality i výzkum nutričních vlastností.

Použitá instrumentace

• UHPLC Nexera system, Shimadzu
• Hmotnostní spektrometr LCMS-8050, Shimadzu
• Kolony: Discovery HS F5-3 (2.1×150 mm, 3 µm), Inertsil ODS-4 (2.1×50 mm, 2 µm), Asahipak NH2P-50 2D (2.0×150 mm, 5 µm)

Reference

Fujito Y., Arakawa K., Hayakawa Y. Comprehensive analysis of primary & secondary metabolites in citrus using an automated method changeover UHPLC system coupled to LC/MS/MS. Shimadzu Corporation, ASMS 2015.