LC-MS Bioanalysis of Antibody Drugs Using Fab-Selective Proteolysis nSMOL - Part 5 – Instrument comparison of precision and accuracy –

Význam tématu

Bioanalýza monoklonálních protilátek vyžaduje vysoce citlivé a selektivní metody kvantifikace. Přesné stanovení koncentrace léčivých protilátek, jako je bevacizumab, je klíčové pro sledování farmakokinetiky, bezpečnosti a účinnosti v klinickém vývoji a monitorování pacientů.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo porovnat přesnost a citlivost analýzy bevacizumabu v lidské plazmě mezi spektrometry Shimadzu LCMS-8050 a konkurenčním hybridním triple kvadrupólem. Předběžná příprava vzorků proběhla pomocí nSMOLTM technologie selektivní proteolýzy oblasti Fab.

Použitá metodika

Pro přípravu vzorků byla použita nSMOLTM proteolýza, která spočívá v následujících krocích:

• Imunoadsorpce všech IgG molekul z plazmy na 100nm průměrných prvcích živice.
• Odfiltrování matricových komponent a promytí živice.
• Proteolýza pomocí 200nm FG kuliček s imobilizovaným trypsinem.
• Zastavení reakce, odstranění živice a FG kuliček spin-filtrem.

MRM podmínky kvantifikačních peptidů (např. 512.1>292.3 pro kvantifikaci) byly optimalizovány pro obě zařízení. Chromatografické parametry:

• Systém: Nexera X2
• Kolona: Shim-pack GISS C18, 50×2.1 mm, 1.9 µm
• Gradient: 1–35 % acetonitrilu s 0.1 % kyselinou mravenčí, 5min eluce

Masse spektrální podmínky:

• Ionizace: ESI pozitivní
• Teploty: DL 250 °C, Block Heater 400 °C, Interface 300 °C
• Plyny: nebulizační 3 L/min, sušící 10 L/min, topný 10 L/min

Použitá instrumentace

• Shimadzu LCMS-8050 triple kvadrupól
• Shimadzu LCMS-8060 (zmíněná optimalizace)
• Konkurent: hybridní triple kvadrupól od jiného výrobce
• Shimadzu Nexera X2 UHPLC systém

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza bevacizumabu v rozmezí 0.146–300 µg/mL splnila kritéria směrodatnosti a přesnosti dle japonské směrnice pro malé molekuly. Pro LCMS-8050 byla průměrná přesnost 100.7 % při %RSD 0.024, zatímco konkurenční systém vykázal horší variabilitu (%RSD 0.212) a nižší přesnost při nízkých koncentracích. Selektivní sběr peptidů minimalizoval matricové rušení a umožnil stabilní signál interního standardu (P14R). Shimadzu přístroj navíc ukázal rychlejší cykly MRM (182 ms vs. 280 ms) a snadnější údržbu (výmena ESI kapiláry bez nářadí, výměna desolvační linky bez rozbíjení vakua).

Přínosy a praktické využití metody

nSMOLTM proteolýza poskytuje univerzální workflow pro různé monoklonální protilátky, zrychluje vývoj bioanalytických metod a snižuje náklady na údržbu LC-MS systému. Metoda je vhodná pro farmaceutický vývoj, kontrolu kvality a klinické farmakokinetické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření nSMOLTM protokolů pro bispecifické protilátky a konjugované léky.
• Automatizace přípravy vzorků a přímé napojení na vysoko-rozlišovací hmotnostní spektrometry.
• Využití strojového učení pro optimalizaci MRM metod a chromatografických podmínek.

Závěr

Metoda nSMOLTM proteolýzy kombinovaná se spektrometrem Shimadzu LCMS-8050 přináší vysoce přesné, citlivé a reprodukovatelné stanovení protilátek v plazmě. Dosahuje lepších parametrů než konkurenční systémy a splňuje přísné validační směrnice pro bioanalýzu.

Reference

• Iwamoto N. et al. Analyst. 2014; DOI:10.1039/c3an02104a
• Iwamoto N. et al. Drug Metab Pharmacokinet. 2015; DOI:10.1016/j.dmpk.2015.11.004