Integration of steroids analysis in serum using LC-MS/MS with full-automated sample preparation

Význam tématu

Stanovení steroidních hormonů v séru je klíčové pro diagnostiku endokrinních poruch, monitorování terapie a farmaceutický výzkum.
Důležité je rychlé, přesné a reprodukovatelné zpracování vzorků s minimální chybovostí.
Automatizace přípravy vzorků přispívá ke zvýšení propustnosti analýz a omezení variability způsobené ruční manipulací.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo propojit plně automatizovanou přípravu vzorků pomocí CLAM-2000 se systémem LC-MS/MS LCMS-8060 za účelem simultánního stanovení deseti steroidů v séru.
Autoři se zaměřili na zkrácení doby přípravy, zvýšení přesnosti a zajištění lineárních kalibračních křivek v širokém rozsahu koncentrací.

Použitá metodika

Vzorek séra (30 µl) byl automaticky smíchán s acetonitrilem obsahujícím interní standardy a po krátké inkubaci a filtraci odeslán k HPLC-MS/MS analýze.
Separace probíhala na Kinetex Biphenyl analytické kolonce při 40 ºC s průtokem 0,3 ml/min a gradientem mobilních fází (1 mM amonného fluoridu ve vodě a methanol).

Použitá instrumentace

Automatizovaný systém CLAM-2000 pro precipitaci proteinů a filtraci vzorků.
HPLC modul s trappingovým stupněm MAYI-ODS a analytickou Kinetex Biphenyl kolonkou.
Triple kvadrupólový hmotnostní spektrometr Shimadzu LCMS-8060 s heated ESI ionizací a optimalizovanými parametry plynů a teplot.
CHS MSMS Steroids Kit od PerkinElmer zajišťující standardy a interní standardy pro všechny analyty.

Hlavní výsledky a diskuse

Linearity pro všech deset steroidů byla potvrzena v rozsazích např. kortizol 1,51–320 ng/ml, aldosteron 0,03–1,14 ng/ml a další, přičemž koeficienty korelace r2 > 0,997.
Reprodukovatelnost (N=3) vykázala CV < 10 % napříč všemi testovanými koncentracemi, včetně LLOQ.
Doba přípravy vzorku se zkrátila ze standardních 60 minut na přibližně 6 minut.
Paralelní zpracování přípravy vzorků a samotné LC-MS/MS analýzy výrazně zvýšilo denní propustnost bez kompromisů na kvalitě dat.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace snižuje manuální chyby, zlepšuje preciznost a významně urychluje workflow.
Metoda je vhodná pro rutinní klinické laboratoře, farmaceutické QA/QC i výzkumná pracoviště vyžadující vysokou propustnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření na širší spektrum biologických markerů a další třídy sloučenin.
Integrace s laboratorními informačními systémy a masové skríningové aplikace.
Vývoj kompaktních integrovaných přístrojů pro rychlou point-of-care detekci steroidů.

Závěr

Prokázali jsme, že propojení plně automatizované přípravy vzorků se citlivou LC-MS/MS detekcí umožňuje spolehlivé a rychlé stanovení deseti steroidů v séru.
Automatizace snižuje dobu přípravy na minimum a současně udržuje vysokou přesnost, linearitu a reprodukovatelnost měření.
Další validace je doporučena pro diagnostické aplikace.

Reference

1. Minohata T, Kawakami D. Integration of steroids analysis in serum using LC-MS/MS with full-automated sample preparation. ASMS 2016 WP-486.
2. Shimadzu Corporation. CLAM-2000 Automated Sample Preparation System User Manual 2016.
3. PerkinElmer. CHS MSMS Steroids Kit Instruction Manual 2015.