Selective and sensitive quantification of glucagon and glucagon-related peptide hormones in human plasma using conventional LC/MS/MS

Význam tématu

Intaktní peptidové hormony, zejména glukagon a jeho proglukagonové deriváty, jsou klíčové pro údržbu glukózové homeostázy a diagnostiku řady metabolických poruch. Tradiční imunochemické metody měření glukagonu však často trpí zkříženou reaktivitou protilátek s homologními peptidy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované práce bylo vyvinout citlivou a selektivní metodu pro kvantifikaci glukagonu, GLP-1 a jejich analogů v lidské plasmě využitím konvenčního kapalinového chromatografu spojení s triple kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem (LC/MS/MS). Studie demonstruje optimalizaci separačních a detekčních podmínek, vývoj přípravy vzorku a ověření výkonu metody na standardech i reálných plasmových vzorcích.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrarychlá kapalná chromatografie: Nexera X2 (Shimadzu) se sloupci Shim-pack ODS II (2,0×150 mm, 1,6 μm) a Kinetex XB-C18 (2,1×100 mm, 2,6 μm).
Detekce: LCMS-8060 (Shimadzu), ESI pozitivní ionizace, režim SRM (MRM) s optimalizovanými přechody pro 4+ až 6+ nabitá stavy glukagonu, insulinu, GLP-1 (7-36) amide, GLP-1 (7-37) a analogů exenatidu, liraglutidu.
Příprava plazmy: odběr do zkumavek s koktejlem proteázových inhibitorů, následná acidifikace 40% octovou kyselinou, alkalizace amoniakem, extrakce na iontovým výměničovým SPE sloupku EVOLUTE EXPRESS AX (Biotage), eluční pufr ACN:H₂O:AcOH 45:25:30 a rozředění pro LC/MS/MS.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla nízké meze detekce glukagonu 2,5 pM při lineární kvantifikaci 2,5–1000 pM (r²>0,999). Při 45 μl injekci vzorku byla dosažena přesnost ≥104 % v nejnižší koncentraci. Na reálných plazmatických vzorcích zdravých dobrovolníků byla prokázána statisticky významná (p<0,01) zvýšená hladina glukagonu ve srovnání nalačno versus náhodný odběr.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita bez zkřížené reaktivity homologních peptidů.
• Citlivost odpovídající fyziologickým hladinám glukagonu.
• Rychlý průtokový režim s cyklem 10–13 minut na analýzu.
• Vhodné pro rutinní studie farmakokinetyky a monitorování endogenního glukagonu u pacientů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj multiplexního kvantitativního měření dalších proglukagonových hormonů v jednom běhu. Integrace stabilně značených vnitřních standardů pro další zvýšení přesnosti. Aplikace vysokopropustných systémů (UHPLC) a iontové mobility pro lepší rozlišení izobarických peptidů.

Závěr

Vyvinutá konvenční LC/MS/MS metoda umožňuje spolehlivou, citlivou a selektivní kvantifikaci glukagonu a souvisejících peptidů v lidské plasmě. Metoda je vhodná pro výzkum regulace glykemie, farmakokinetické studie a potenciálně i klinické aplikace po dalším ověření.

Reference

• Matsubara T., Yokoi N., Hoshikawa R., Hirano I., Seino S. Selective and sensitive quantification of glucagon and glucagon-related peptide hormones in human plasma using conventional LC/MS/MS. ASMS 2016, ThP-494.