Analysis of Short-Chain Fatty Acids/Organic Acids (3-NPH Derivatives) in Fecal Specimens from SPF and Antibiotic-Fed Mice

Význam tématu

Intestinální mikrobiota produkuje krátké mastné kyseliny (KMK) a organické kyseliny, které ovlivňují homeostázu hostitele a jsou spojovány s imunitními i metabolickými onemocněními. Kvalitní kvantitativní analýza těchto látek ve vzorcích stolice je proto klíčová pro pochopení vazeb mezi střevními bakteriemi a zdravím.

Cíle a přehled studie

Tento článek popisuje metodu derivatizace 3-nitrofenylhydrazinem (3-NPH) pro současnou analýzu C2–C5 krátkých mastných kyselin a vybraných organických kyselin ve stolici myší pomocí LC-MS/MS. Studie porovnává hladiny těchto látek u SPF (Specific Pathogen Free) myší a u myší s výrazně redukovanou mikrobiotou po podání antibiotik.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky stolice byly suspendovány v ethanolu, centrifugovány a supernatant podroben derivatizaci v roztoku 3-NPH za přítomnosti EDC a pyridinu při pokojové teplotě po dobu 30 min.

• Kolonka: Mastro™ C18, 2,1 mm × 150 mm, 3 µm.
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě; B: acetonitril; gradient, 0,35 mL/min, 40 °C.
• Detekce: LCMS-8060 (Shimadzu).
• Ionizace: ESI v pozitivním a negativním režimu.
• MRM přechody optimalizované pro 3-NPH deriváty.
• Parametry: nebulizér 2,0 L/min, sušení 10,0 L/min, DL 250 °C, heat block 400 °C, interface 300 °C, CID 270 kPa.

Hlavní výsledky a diskuse

MRM chromatogramy prokázaly výrazné snížení koncentrací KMK (octová, propionová, máselná, valeriová, iso-butyrová, iso-valeriová) u antibiotiky ošetřených myší oproti SPF kontrolám. Naopak organické kyseliny s karbonylovou skupinou (např. pyruvát, jantarová, malát) a zejména jantarová kyselina vykázaly zvýšené hladiny v antibiotikách ošetřené skupině. Tyto změny odrážejí potlačení bakteriální aktivity a posun v metabolickém profilu.

Přínosy a praktické využití metody

• Efektivní derivatizace ve vodném prostředí minimalizuje ztráty těkavých složek.
• Jednoznačná separace a citlivá detekce KMK i organických kyselin v jednom běhu LC-MS/MS.
• Vhodné pro farmakologické, nutriční a mikrobiologické studie založené na analýze střevního metabolomu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Použití 3-NPH derivatizace lze rozšířit na širší spektrum kyselin zahrnujících hydroxy- nebo dikarboxylové deriváty. Kombinace s vysokorozlišovacími hmotnostními analyzátory přinese hlubší vhled do metabolitů střevní mikrobioty. Automatizované platformy vzorkování a datová analýza pak podpoří screening ve velkých koherentních studiích.

Závěr

Metoda 3-NPH derivatizace s následující LC-MS/MS analýzou umožňuje spolehlivě kvantifikovat krátké mastné kyseliny a organické kyseliny ve vzorcích stolice. Rozdíly mezi SPF a antibiotikem ošetřenými myšmi potvrzují citlivost této metody k detekci změn mikrobiální aktivity.

Reference

• Gut Microbes. 5(3):333-9. 2014. Characterization of the 17 strains of regulatory T cell-inducing human-derived Clostridia. Narushima S., Sugiura Y., Oshima K., Atarashi K., Hattori M., Suematsu M., Honda K.
• Specimen provider: Dr. Yuki Sugiura and Prof. Makoto Suematsu, Department of Biochemistry & Integrative Medical Biology, Keio University School of Medicine.