Simultaneous analysis of primary metabolites by triple quadrupole LC/MS/MS using pentafuorophenylpropyl column

Význam tématu

Schopnost simultánně kvantifikovat velké množství primárních metabolitů je klíčová pro sledování dynamiky buněčného metabolismu a rychlé detekce změn v biochemických cestách. Tradiční ODS kolony jsou pro tyto účely omezené kvůli nízké afinitě k hydrofilním sloučeninám. Použití pentafluorofenylpropyl (PFPP) kolon přináší lepší retenci a selektivitu pro rozmanitou škálu polarit. Simultánní měření až 97 metabolitů zkracuje analýzy a zvyšuje kapacitu laboratoří zabývajících se metabolomikou, farmakologií či toxikologií.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie byla optimalizace a validace metody pro simultánní analýzu 97 primárních metabolitů pomocí triple kvadrupólového LC/MS/MS v režimu MRM s PFPP kolonou. Metoda byla aplikována na standardní směsi a biologické vzorky (myší játra a srdce) a porovnána s iontově-vazebnou chromatografií z předchozích studií.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Nexera systémy (Shimadzu)
• Kolona: Discovery HS F5 (PFPP) 150×2,1 mm, 3 µm
• MS: LCMS-8030 a LCMS-8040 triple kvadrupólové spektrometry

Použitá metodika

Standardy 97 metabolitů byly připraveny v rozsahu 10–10000 nM (některé 100–10000 nM, 1000–10000 nM) a injikovány (3 µL) pro tvorbu kalibračních křivek. Biologické vzorky (játra/srdce) extrahovány chloroform-methanolovou metodou, filtrace 5 kDa, sušení a rehydratace. Mobilní fáze A: 0,1 % formiát ve vodě, B: 0,1 % formiát v acetonitrilu, gradient 0–95 % B v 15 min, průtok 0,25 mL/min, teplota kolony 40 °C. MS režim: pozitivní/negativní ionizace, MRM, DL 250 °C, HB 400 °C, sušící plyn 10 L/min, nebulizační 2 L/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizací FIA byly stanoveny MRM přechody pro všech 97 metabolitů s liniaritami R² ≥ 0,97. Chromatografická separace PFPP kolony umožnila kvalitní rozlišení většiny sloučenin pod 15 min. V aplikaci na myší játra bylo detekováno 83/97 a na srdci 88/97 metabolitů, včetně charakteristických markerů (GSH, AMP, acetylcarnitin aj.). Komparací s iontově-vazebnou metodou pro 25 metabolitů byla ve většině případů potvrzena konzistentní relativní kvantifikace (20/25), slabší detekce TMP, cAMP, cGMP, cysteinu a tryptofanu byla omezená nízkou citlivostí v jednom z režimů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé vysokopropustné profilování komplexních vzorků
• Široké spektrum primárních metabolitů v jednom běhu
• Eliminace iontově-vazebných činidel a souvisejících artefaktů
• Vhodné pro biochemické studie, toxikologii a metabolomické screeningy

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu na sekundární metabolity a lipidy
• Integrace stabilně značených interních standardů pro absolutní kvantifikaci
• Automatizace přípravy vzorků a datové analýzy
• Uplatnění v klinickém sledování biomarkerů a personalizované medicíně

Závěr

Vyvinutá metoda PFPP-LC/MS/MS umožňuje rychlou a spolehlivou analýzu až 97 primárních metabolitů srovnatelnou s iontově-vazebnou chromatografií. Výborná separace, citlivost a reprodukovatelnost potvrzují její potenciál pro rutinní kvantitativní metabolomiku.