Reliable Quantitation of 52 L-Amino Acids in Human Plasma for Clinical Research by LC-MS/MS

Význam tématu

Aminokyseliny představují klíčové biomolekuly zapojené do syntézy bílkovin a řady metabolických drah.
Přesná kvantifikace jejich hladin v lidské plazmě je nezbytná pro odhalení metabolických poruch a pro klinický výzkum.
Tradiční metody často vyžadují časově náročnou derivatizaci a víceúrovňovou přípravu vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout spolehlivou LC-MS/MS metodu pro simultánní kvantifikaci 52 L-aminokyselin bez derivatizace vzorku.
Metoda využívá offline precipitaci proteinů, diluci se stabilně označenými standardy a 18minutovou chromatografickou separaci na reverzní fázi.
Kalibrace je prováděna osmikorovými standardy v rozsahu 0,1–500 µM.

Použitá metodika a instrumentace

• příprava vzorku: 100 µL plazmy s přidáním precipitantu, vortex, chlazení, centrifugace a následná diluce supernatantu se standardy;
• LC podmínky: Vanquish Flex se systémem trap-guard-analytickou kolonu, 18min gradient, teplota 30 °C, objem injekce 4 µL;
• MS podmínky: TSQ Quantis triple kvadrupol, HESI zdroj v pozitivním módu, napětí 3,5 kV, průtoky plynů: sheath 45, auxiliary 15, sweep 0 (jednotky), teplota kapiláry 270 °C, vaporizer 370 °C;
• SRM detekce: optimalizované prekurzorové a produktové ionty pro každou aminokyselinu, časový cyklus 0,4 s, tlaky kolizního plynu 1,5 mTorr;
• kalibrace: interní i externí, lineární či kvadratická regrese s vážením 1/X nebo 1/X2.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje LLOQ definovaných jako nejnižší bod kalibrace se <20 % chyby a <20 % CV.
Pro většinu aminokyselin byly regresní koeficienty R2 >0,98.
Optimalizace LC eliminovala carry-over zásadních aminokyselin pomocí cation-exchange trap kolony a udržela nutné pH odchylky pod 0,1 mezi běhy.
Střední úrovně QC vykázaly opakovatelnost % RSD <5 % pro většinu analyzovaných sloučenin.

Přínosy a praktické využití metody

• zkrácení doby přípravy vzorku a analýzy (18 min proti hodinovým HPLC postupům);
• eliminace derivatizace snižuje náklady na reagencie a riziko chyb při manipulaci;
• simultánní kvantifikace 52 aminokyselin v biologických vzorcích vhodná pro klinický výzkum a vedení metabolických profilů;
• vysoká reprodukovatelnost a robustnost pro rutinní QA/QC aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• rozšíření validace na všechny 52 aminokyselin v klinických studiích;
• integrace s HRMS a dalšími platformami pro objev metabolitů;
• automatizovaná příprava vzorků pro vysokoprůchodnost;
• použití v personalizované medicíně a farmakometabolomice.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda umožňuje rychlou a spolehlivou kvantifikaci 52 L-aminokyselin bez derivatizace.
Je charakterizována vysokou citlivostí, přesností a opakovatelností vhodnou pro klinický výzkum.

Reference

• Samra S, Thibert V, Netter C. Reliable Quantitation of 52 L-Amino Acids in Human Plasma for Clinical Research by LC-MS/MS. Thermo Fisher Scientific, 2019.