Novel capillary-flow LC HRAM MS platform for fast targeted analysis and robust profiling of complex samples

Význam tématu

Kapilárně průtočná LC-MS platforma spojuje rychlost a robustnost analytického průtoku s citlivostí nano-LC, což je klíčové pro rutinní proteomické profilování komplexních vzorků a cílenou kvantifikaci biologických markerů či léčiv. Snížená spotřeba rozpouštědel, nižší riziko kontaminace a vysoká průchodnost vzorků dělají z této technologie atraktivní řešení pro laboratoře QA/QC i výzkumné skupiny.

Cíle a přehled studie

V práci autorů z Thermo Fisher Scientific a partnerských institucí je popsána nová kapilárně-průtočná LC platforma složená z UltiMate 3000 RSLCnano systému, EASY-Spray 150 µm ID kolony a hmotnostního spektrometru Q Exactive HF-X. Studie hodnotila citlivost, reprodukovatelnost, chromatografickou výkonnost a robustnost při různých režimech (shotgun DDA, PRM) a ukázala využitelnost jak pro širokospektrální, tak cílené analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda zahrnovala:

• Separace peptidů na EASY-Spray C18 kolóně (150 µm×150 mm, 2 µm) při průtocích 1,2 µL/min (vyšší citlivost) a 3 µL/min (vyšší průchodnost).
• Použití předkoncentračního módu s injekční smyčkou 20 µL nebo přímá injekce 5 µL.
• Mobily fáze A: voda + 0,1 % FA, fáze B: acetonitril + 0,1 % FA; gradienty 16–90 min.
• Detekce na Q Exactive HF-X v režimech Full-scan MS, DDA (TopN=40, MS1 60 000, MS2 7 500, IT MS2 35 ms) a PRM pro cílené měření.
• Software: Xcalibur 4.0, TraceFinder, Proteome Discoverer, Skyline SII.

Hlavní výsledky a diskuse

• Srovnání se standardními analytickými průtoky (450 µL/min) prokázalo až 40× vyšší citlivost a jen 2–4× nižší citlivost než nanoLC při stejném množství vzorku.
• Chromatografická šířka stop (~3 s při 3 µL/min, <15 s při 1,2 µL/min) umožnila dosažení kapacity ~300 píků.
• Retenční časy stabilní s RSD<1 % při 350 injekcích, intenzity MS1 signálů s RSD<10 % po 150 injekcích bez interní korekce.
• Shotgun profilování HeLa lyzátu: >3500 proteinů a 20 000 peptidů za 60 min a až 4300 proteinů s vyšším naložením vzorku.
• Jednostřelové DDA hrubé plazmy: identifikováno >200 proteinů a ~2000 peptidů z 1 µL digesátu.
• PRM kvantifikace trastuzumabu: baseline separace deamidovaných izomerů YPTNGYTR v 12 min, lineární rozsah 500 ng–500 µg/mL (LLOQ ~2 fmol na kolonu).

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká průchodnost a nízká spotřeba rozpouštědel umožňují rutinní nasazení ve výzkumu i kontrole kvality.
• Platforma je vhodná pro analýzu biologických tekutin, proteomové profilingy i cílenou kvantifikaci terapeutik.
• Snížená nutnost předúprav a vysoká robustnost zkracují dobu analýzy a eliminují přerušení provozu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace kolonnových materiálů a gradientních protokolů pro rozšíření aplikací do metabolomiky nebo lipidomiky.
• Integrace automatizovaných přípravných robotických linek pro zlepšení reprodukovatelnosti a throughputu.
• Sledování biotherapeutik a degradačních produktů v klinických studiích a farmakokinetických analýzách.

Závěr

Nová capLC-MS platforma spojuje vysokou citlivost, robustnost a průchodnost vzorků. Umožňuje kvalitativní i kvantitativní proteomické studie v krátkém čase s minimální spotřebou rozpouštědel a vysokou stabilitou výsledků.

Reference

1. Boychenko A., Meding S., Samonig M., Swart R. Sensitive, Fast and Robust Quantification of Antibodies in Complex Matrices by Capillary Flow UHPLC and High-Resolution Accurate-Mass MS. ASMS2016, PN64787.
2. Boychenko A., Meding S., Decrop W., Baynham M., Ruehl M., Wong J.-M.T., Markus M., Swart R. Deep and Reproducible Human Proteome Profiling with Novel Nano Flow LC Technology and HRAM Mass-Spectrometry. Pittcon2017, PO72267.
3. Bults P., Bischoff R., Bakker H., Gietema J.A., van de Merbel N.C. LC-MS/MS-Based Monitoring of In Vivo Protein Biotransformation: Quantitative Determination of Trastuzumab and Its Deamidation Products in Human Plasma. Anal. Chem. 2016, 88(3):1871–1877.