Confident peptide mapping and disulfide bond analysis of an IgG2 monoclonal antibody

Význam tématu

Biotechnologické léky, zejména monoklonální protilátky, vyžadují detailní charakterizaci kritických kvalitativních atributů (CQA).
Důležitým aspektem je potvrzení primární sekvence a strukturních vazeb, zejména disulfidických můstků, které ovlivňují stabilitu a funkci protilátek.

Cíle a přehled studie / článku

• Prezentovat schopnosti Orbitrap Exploris 240 MS v rutiní LC-MS peptide mapping analýze bioterapeutik.
• Ukázat 100% pokrytí sekvence IgG2 protilátky denosumabu v redukovaných i neredukovaných podmínkách.
• Prezentovat detekci nízkopoměrových post-translačních modifikací a mapování intra- a inter-řetězcových disulfidických vazeb.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Vanquish Duo UHPLC (dva Flex Binary Pumps, Split Sampler, Column Compartment) s Acclaim VANQUISH C18 kolonkou.
• Mobilní fáze: voda a acetonitril s 0,1% kyselinou mravenčí, průtok 0,3 mL/min, injekce 10 µL.
• Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Exploris 240 MS (MS1 rozlišení 120 000 FWHM, MS2 15 000 FWHM, ddTop5), BioPharma Option.
• Software: Xcalibur 4.2 pro řízení instrumentu, BioPharma Finder 4.0 pro datovou analýzu.
• Automatizovaná proteolýza: SMART Digest Trypsin kit na KingFisher Duo Prime.

Hlavní výsledky a diskuse

• Peptide mapping dosáhl 100% pokrytí jak lehkého, tak těžkého řetězce denosumabu.
• Mapování disulfidických vazeb prokázalo všechny očekávané intra- a inter-řetězcové můstky s přesností masek < 3 ppm.
• Nízká úroveň deamidace (~2,5 %) v místě N362 byla citlivě detekována pomocí HRAM MS/MS s jasným rozlišením izotopových vzorců.
• Metoda prokázala vysokou reprodukovatelnost, jednoduchou přenositelnost a rychlé nastavení protokolu mezi laboratořemi.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda umožňuje komplexní kontrolu CQA bioterapeutik včetně potlačení falešně negativních výsledků.
• Vysoká citlivost a přesnost zajišťují důvěru v detekci i stopových modifikací.
• Jednoduché přenastavení protokolu a šablony v softwaru podporují rutinní provoz v QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace přípravy vzorků a integrace s LIMS pro zvýšení throughputu.
• Aplikace datově řízených přístupů (DIA, strojové učení) pro hlubší charakterizaci a predikci stability.
• Rozšíření metodiky na další třídy protilátek, konjugátů a pokročilá bioterapeutika.

Závěr

Orbitrap Exploris 240 MS v kombinaci s LC-MS peptide mappingem poskytuje plnou sekvenční pokrytí, přesné mapování disulfidických vazeb a citlivou detekci nízkopoměrových PTM. Metoda nabízí vysokou spolehlivost, přenositelnost a jednoduchou obsluhu, což ji činí vhodnou pro rutinní charakterizaci bioterapeutik.

Reference

• Carillo S., Bones J., Buchanan T. Confident peptide mapping and disulfide bond analysis of an IgG2 monoclonal antibody. Thermo Fisher Scientific Application Brief 73556, 2020.