Fully Automated Analysis of Doping Substances in Equine Urine by Disposable Pipette Extraction (DPX) coupled to GC/QqQ-MS

Význam tématu

V oblasti závodního jezdectví je nezbytné detekovat nedovolené látky ve vzorcích moči koní s vysokou citlivostí a selektivitou. Automatizovaná příprava vzorků zjednodušuje práci laboratoří, snižuje riziko chyb obsluhy a zvyšuje opakovatelnost analýzy. Dispersní extrakce DPX ve spojení s GC/QqQ–MS poskytuje robustní postup pro rychlý screening a kvantifikaci výkonově účinných látek v komplexním biologickém matrice.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout plně automatizovanou metodu pro extrakci, čištění a analýzu vybraných dopingových látek v konské moči. Studie využívá GERSTEL MultiPurpose Sampler (MPS) s DPX modul, velkoobjemovou injekci (LVI), zpětný splach kolony a detekci na triple-kvadruplórovém hmotovém spektrometru. Metoda je validována pro osm modelových sloučenin zahrnujících steroidy, psychotropní látky a stimulanty.

Použitá instrumentace

• GERSTEL MultiPurpose Sampler Dual Head s modulem Disposable Pipette Extraction (DPX)
• Cooled Injection System (CIS) PTV s Automated Liner EXchange (ALEX)
• GC Agilent 7890 se dvěma kolonkami HP-5ms Ultra Inert (30 m × 0.25 mm, 0.25 µm) a Rxi-17Sil MS (30 m × 0.25 mm, 0.25 µm) v setupu 2D-GC
• Triple-kvadruplórové hmotové spektrometr Agilent 7000 (QqQ-MS) pro SRM detekci
• Cryo Trap System (CTS 2) pro heart cutting ve 2D-GC
• Centrifuga integrovaná v MPS pro fázi alkalizace a očištění vzorku

Použitá metodika

Vzorky konské moči byly alkalizovány 1 N NaOH a centrifugovány. Extrakce probíhala v DPX špičkách typu WAX (weak anion exchange) následujícím postupem:

• Conditioning: 500 µL metanolu + 2 mL vody
• Extrakce: 3× aspirace 740 µL vzorku s turbulizací vzduchem
• Washing: 2 mL vody
• Eluce: 500 µL acetonu

Eluát byl smíchán a velkoobjemově (8 µL) vstříknut do CIS PTV. GC běželo při programu 100 °C (3 min) → 15 °C/min → 320 °C (1 min + post run), tok helia 1,2 mL/min (1. dimenze) a 1,4 mL/min (2. dimenze). QqQ-MS pracoval v SRM režimu se třemi přechody na analyte.

Hlavní výsledky a diskuse

DPX WAX poskytl výrazně lepší čištění oproti reverzní a polární fázi, odstraňoval fenoly z matrix a ponechával analyty v eluátu. Optimalizace conditioning, washing a volby elučního činidla (aceton) vedla k návratnosti 85–106 % a limitům kvantifikace 0,1–10 ng/mL. Zvýšení injekčního objemu na 8 µL přineslo efekt matric-induced response enhancement, zlepšující citlivost bez zhoršení opakovatelnosti. Zpětný splach kolony a výměna lineru (ALEX) zajišťují velmi stabilní retenční časy (RSD < 0,03 min). Porovnání SRM QqQ-MS, 2D-GC SIM a SIM-MS prokázalo nejvyšší selektivitu a S/N pro SRM QqQ-MS (např. S/N ≈ 1750 pro diazepam).

Přínosy a praktické využití

• Plně automatizovaná příprava vzorků i analýza zkracuje dobu na vzorek na ~15 min a zvyšuje průtok vzorků
• Robustní čištění složité matrice konské moči s nízkými lidskými zásahy
• Vysoká citlivost (LCQ, SRM) umožňuje detekci stopových koncentrací výkonových látek
• Flexibilita rozšíření o další analyty při zachování automatizované platformy

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o LC/QqQ–MS analýzu polarnějších látek po úpravě eluátu (aceton → acetonitril pro HILIC nebo ředění pro RP kolonu). Integrace on-line konjugátové hydrolýzy a automatizované derivatizace by umožnila širší panel steroidů a metabolitů. Kombinace DPX s vysokorozlišovacími MS systémy (Q-ToF, Orbitrap) by dále zvýšila schopnost identifikace neznámých dopingových látek.

Závěr

Vyvinutá plně automatizovaná DPX/LVI/GC/QqQ–MS metoda umožňuje citlivou a selektivní analýzu vybraných dopingových látek v konské moči s nízkými limity kvantifikace, dobrou opakovatelností a vysokou průchodností. Využití DPX WAX, velkoobjemové injekce, zpětného splachu kolony a SRM QqQ-MS zajišťuje robustní stanovení v souladu s požadavky kontrolních orgánů.

Reference

1. R. K. Barnhart, Chambers Dictionary of Etymology, Edinburgh 2006
2. C. H. F. Wong et al., J. Chrom. A 1232 (2012), 257–265
3. W. H. Kwok et al., J. Chrom. A 1217 (2010), 3289–3296
4. Y. Liu et al., Anal. Chem. 83 (2011), 6834–6841
5. ARCI: http://arci.com
6. IFHA: http://www.horseracingintfed.com/resources/2009DopingControl_Report.pdf
7. K. Mastovska et al., Anal. Chem. 77 (2005), 8129–8137
8. B. P. Gray, P. Teale, J. Chrom. A 1217 (2010), 4749–4752