TOC-L with TNM-L: Simultaneous Measurement of CO2 Fixation and Nitrogen Content in Microalgal Biomass

TOC-L s TNM-L: Simultánní měření fixace CO2 a obsahu dusíku v biomase mikrořas — Shrnutí aplikace

Význam tématu:
Microalgae představují perspektivní zdroj pro udržitelný letecký biopaliv (SAF) díky vysoké produktivitě lipidů a schopnosti fixace CO2. Kvantifikace množství CO2 přeměněného na organický uhlík a současné sledování nitrogenního stavu buněk jsou klíčové pro hodnocení environmentálního přínosu (LCA) i pro optimalizaci bioprodukčního procesu. Metoda TOC-L s jednotkou TNM-L umožňuje rychlé, kvantitativní a simultánní stanovení TOC a celkového dusíku (TN) v kapalných suspenzích bez nutnosti sušení vzorku, což zrychluje analytický workflow a zvyšuje relevanci dat pro procesní rozhodování.

Cíle a přehled studie / článku:
Hlavním cílem bylo demonstrovat použití analyzátoru TOC-L vybaveného jednotkou TNM-L pro současné vyhodnocení fixace CO2 (pomocí TOC) a nitrogenního stavu buněk v kultuře Chlamydomonas reinhardtii CC-1010. Studie sledovala vliv kumulativní intenzity osvětlení a buněčného obsahu dusíku na produkci biomasy, celkový organický uhlík v biomase i v supernatantu a na akumulaci lipidů (vyhodnocovanou jako FAME). Cílem bylo také vyhodnotit praktické implikace pro řízení kultivace směrem k maximalizaci lipidové produktivity a CO2 fixace.

Použitá metodika a instrumentace:

• Příprava vzorku: centrifugace kultury 5 000×g, 5 min (oddělení pelletu a supernatantu), vypláchnutí pelletu ultrapure vodou, opětovná centrifugace; pellet resuspendován a homogenizován sonikací před měřením.
• TOC/TN měření: Shimadzu TOC-LCPH total organic carbon analyzer s TNM-L total nitrogen unit. Principy: TC - spalovací katalytická oxidace / detekce NDIR, IC - acidifikace a sparging / NDIR, TN - termická dekompozice / chemiluminiscence. Vzorkovací objemy: TC a TN 50 µL, IC 250 µL. Kalibrační standardy: potassium hydrogen phthalate (TC), sodium bicarbonate (IC), potassium nitrate (TN).
• Sušení a stanovení suché hmotnosti: metoda podle ASTM D5907 (filtrace přes Whatman GF/B, oplach, sušení při 100 °C, vážení) pro výpočet DCW.
• Analýza lipidů (FAME): extrakce z lyofilizovaných buněk pomocí CHCl3/MeOH (2:1) se 0,1 mm zirkoniovými kuličkami; interní standard tripentadecanoin; sušení extraktu, metylace v 5% H2SO4/MeOH při 70 °C po dobu 3 h; extrakce hexanem a analýza pomocí GCMS-TQ 8040 NX.

Hlavní výsledky a diskuse:

• Biomasa a organický uhlík v biomase (TOC) rostly s rostoucí kumulativní intenzitou osvětlení. TOC v biomase koreloval s koncentrací biomasy.
• Lipidový obsah buněk se zvyšoval při snižujícím se obsahu dusíku v buňkách; kumulativní osvětlení mělo na lipidovou frakci menší přímý vliv.
• TOC obsahu v biomase mírně klesal při nedostatku dusíku, zatímco TOC v supernatantu vykazoval obdobný trend. Pokles TOC při N-deficitu je interpretován jako kompromis mezi akumulací lipidů (redistribuce uhlíku do triacylglycerolů) a celkovou schopností fixovat CO2 — buňky při N-deficitu omezují dělení a mohou snižovat fotosyntetickou aktivitu na buňku.
• Pokles buněčné koncetrace s ubývajícím dusíkem potvrzuje, že zvýšení lipidů často neznamená dodatečnou fixaci uhlíku, ale přerozdělení existujícího uhlíkového materiálu.
• Výsledky podporují strategii řízení kultivačního režimu: udržet dostatek dusíku během exponenciální fáze pro maximální produktivitu biomassy a CO2 fixaci a iniciovat N- vyčerpání až po dosažení požadované buněčné hustoty jako spínač pro indukci lipidové akumulace.

Přínosy a praktické využití metody:

• TOC-L s TNM-L umožňuje simultánní a rychlé stanovení TOC a TN v kapalných suspenzích bez sušení, což urychluje sběr dat pro LCA a provozní optimalizaci.
• Metoda podporuje rozhodování o výživě (N management) kultivací pro dosažení rovnováhy mezi biomassovou produktivitou, lipidovou výtěžností a efektivní fixací CO2.
• Kombinace TOC/TN dat s DGW (DCW) a FAME analýzou (GC-MS/MS) poskytuje komplexní obraz metabolismu uhlíku a dusíku a je přímo využitelná při zavádění procesního řízení a škálování produkce SAF z mikrořas.

Budoucí trendy a možnosti využití:

• Integrace online nebo častěji frekvenčně prováděných TOC/TN měření do procesního řízení fotobioreaktorů pro dynamické řízení dávkování živin (zejména dusíku).
• Propojení TOC/TN dat s dalšími senzory (např. plynové výměny, chlorofylový fluorometr) a modelováním pro prediktivní kontrolu produkce lipidů a CO2 fixace.
• Rozšíření metody o izotopové (13C) studie pro přímé kvantifikování zdrojů uhlíku a toků uhlíku v buňce.
• Species-specifická kalibrace a validace pro komerčně relevantní řasy a v podmínkách průmyslového škálování (otevřené nádrže vs. uzavřené PBR).
• Možné kombinace s technikami pro separaci extracelulárních organických látek a hodnocení jejich vlivu na LCA a provozní ekonomiku.

Závěr:
Studie ukazuje, že analýza TOC v kombinaci s TN poskytuje rychlý a integrovaný náhled na schopnost mikrořas fixovat CO2 a na jejich nitrobuněčný dusíkový stav, který přímo ovlivňuje lipidovou akumulaci. Sledování těchto parametrů umožňuje optimalizovat kultivační strategie tak, aby bylo dosaženo co nejlepšího kompromisu mezi produkcí biomasy, lipidy relevantními pro SAF a celkovou efektivitou fixace uhlíku — což je zásadní pro spolehlivé hodnocení udržitelnosti a pro zavádění mikrořasových feedstocků do průmyslové výroby paliv.

Použitá instrumentace:

• Shimadzu TOC-LCPH Total Organic Carbon Analyzer s TNM-L Total Nitrogen Unit (TOC/TN analyzátor).
• GCMS-TQ 8040 NX pro FAME analýzu.
• Whatman GF/B skleněný filtr pro stanovení SS / DCW.
• Sonikátor pro homogenizaci vzorků; centrifuga (5 000×g); lyofilizátor pro sušení buněk; zirkoniové 0,1 mm kuličky pro mechanickou disruptaci buněk.
• Chemikálie a činidla: CHCl3/MeOH (2:1), 5% H2SO4/MeOH pro metylaci, tripentadecanoin jako interní standard, standardy pro kalibraci (potassium hydrogen phthalate, sodium bicarbonate, potassium nitrate).

Reference:

1. Algae Harmonization Study: Evaluating the Potential for Future Algal Biofuel Costs, Sustainability, and Resource Assessment from Harmonized Modeling. 2017 Technical Report.
2. Lim Y. A., Chong M. N., Foo S. C., Ilankoon I. M. S. K., Analysis of direct and indirect quantification methods of CO2 fixation via microalgae cultivation in photobioreactors: A critical review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 137, 110579 (2021).
3. American Society for Testing and Materials. ASTM D5907: Standard Test Methods for Filterable Matter (Total Dissolved Solids) and Nonfilterable Matter (Total Suspended Solids) in Water. ASTM International (2019).
4. Marutani T., Yoshino H., Aoyanagi T., Nishio Y., Nagao Y., GCMS-Based Evaluation of Fatty Acid Composition in Microalgae. Shimadzu Corporation Application Note No.106 (2024).
5. Anjos M., Fernandes B. D., Vicente A. A., Teixeira J. A., Dragone G., Optimization of CO2 bio-mitigation by Chlorella vulgaris. Bioresource Technology, 139, 149–154 (2013).
6. Sun Z., Bo C., Cao S., Sun L., Enhancing CO2 Fixation in Microalgal Systems: Mechanistic Insights and Bioreactor Strategies. Marine Drugs, 23(3), 113 (2025).
7. James G. O. et al., Fatty acid profiling of Chlamydomonas reinhardtii under nitrogen deprivation. Bioresource Technology, 102(3), 3343–3351 (2011).
8. Boyle N. R. et al., Three acyltransferases and nitrogen-responsive regulator implicated in nitrogen starvation-induced TAG accumulation in Chlamydomonas. Journal of Biological Chemistry, 287(19), 15811–15825 (2012).
9. Yang D. et al., Lipidomic Analysis of Chlamydomonas reinhardtii under Nitrogen and Sulfur Deprivation. PLoS One, 10(9): e0137948 (2015).
10. Fakhry E. M., El Maghraby D. M., Lipid accumulation in response to nitrogen limitation and temperature variation in Nannochloropsis salina. Botanical Studies, 56(1):6 (2015).
11. Rios L. F. et al., Nitrogen starvation for lipid accumulation in Desmodesmus sp. Applied Biochemistry and Biotechnology, 175(1), 469–476 (2015).
12. Li X. et al., A galactoglycerolipid lipase required for TAG accumulation after N deprivation in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell, 24(11), 4670–4686 (2012).
13. Bhatnagar V. S. et al., Triacylglycerol synthesis in microalgae under abiotic stress: an updated integrative review. Plant & Cell Physiology, 67(8), 1263–1286 (2026).