PURIFICATION OF RADIOLIGAND PRECURSOR PSMA-617 FROM A FORCED DEGRADATION STUDY USING A WATERS MAXPEAK PREMIER OBD PREPARATIVE COLUMN

Význam tématu

Radioligandová terapie (RLT) vyžaduje přesné a rychlé izolování radioligandových prekurzorů a jejich degradantů pro účely kontroly kvality, charakterizace a přípravy referenčních materiálů. PSMA-617 je prekurzor používaný v cílené terapii nádorů a jeho rychlá, efektivní purifikace je klíčová zejména vzhledem k časové náročnosti a kratké poločase radioizotopů. Použití inertních povrchů kolony a optimalizovaných (focused) gradientů minimalizuje nežádoucí interakce s kovovým povrchem a usnadňuje škálování analytické metody na preparativní úroveň.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo připravit a ukázat škálovatelnou chromatografickou metodu pro separaci PSMA-617 od degradantů vzniklých při nucené degradaci, s důrazem na: izolaci cílové látky ve vysoké čistotě, identifikaci a obohacení dvou blízce elujících nečistot a demonstraci výhod použití MaxPeak Premier (HPS) inertní technologie a XSelect CSH Phenyl-Hexyl stacionární fáze při analyticko-preparativním přechodu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika - příprava vzorku a nucená degradace:

• Stock PSMA-617: 5 mg/mL ve vodě.
• Tři 4 mL alikvoty degradovány zvlášť přidáním 400 µL katalyzátoru: 1 N HCl (kyselé podmínky), 1 N NaOH (zásadité) nebo 3 % H2O2 (oxidační), inkubace při 70 °C po dobu 24 h.
• Po degradaci byly vzorky sloučeny do jedné 20 mL vialky pro další zpracování.

Chromatografické podmínky:

• Mobilní fáze A: voda s 0,1 % kyselinou mravenčí; B: methanol s 0,1 % kyselinou mravenčí.
• Analytické kolony: XSelect Premier CSH Phenyl-Hexyl, 2.1×100 mm, 2.5 µm; průtok 0.35 mL/min; teplota 40 °C; injekce 2–10 µL.
• Preparativní kolona: XSelect Premier CSH Phenyl-Hexyl OBD, 10×150 mm, 3.5 µm (MaxPeak Premier inertní hardware); průtok 5.67 mL/min; injekce 68 µL.
• Vyvíjeny focused gradienty: původní scouting 5–95 % B; upravené focused gradienty (např. 5–45 % B potom 45–54 % B; výsledný rozsah 45–54 % B se ukázal jako optimální pro separaci blízkých nečistot).

Instrumentace (samostatná sekce):

• Analytika: ACQUITY UPLC H-Class (Quaternary Solvent Manager, Sample Manager FTN-H, Column Manager), TUV detektor a ACQUITY QDa MS (ESI+).
• Preparativa: Waters AutoPurification System (2545 Binary Gradient Module, 2767 Sample Manager, System Fluidics Organizer, 2998 PDA Detector), Timberline Column Heater; 500 µL nerezová smyčka (stainless steel loop) pro systém.
• MaxPeak Premier OBD technologie – inertní povrch zabraňující non-specific adsorption (NSA) na kovové povrchy.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky nucené degradace ukázaly, že ve směsi existují nečistoty elující těsně před a těsně za hlavním signálem PSMA-617. Původní širší focused gradient (51–59 % B) nestačil na rozlišení hlavní špičky od následně elujících dvou malých nečistot. Úpravou na 45–54 % B bylo dosaženo potřebného rozlišení.

Analytická a preparativní chromatografie se dobře škálovaly: L/dp poměry byly porovnatelné (40 000 pro 2.5 µm analytickou kolonu vs. 42 857 pro 3.5 µm preparativní kolonu), což umožnilo přímé přenesení retenčních poměrů a zjednodušilo identifikaci píků při purifikaci.

MS identifikace (ESI+, scan) ukázala, že PSMA-617 generuje ionty m/z 1042 (1+) a 521 (2+). Tři následující nečistoty sdílely páry iontů m/z 1024 a 512 (pravděpodobně jednáno o obdobné dvojnásobné/násobné nabité fragmenty nebo deriváty). Preparativní izolace umožnila obohatit dvě navazující nečistoty (peaks 3 a 4) a získat čistý PSMA-617 (potvrzeno UV a MS analýzou frakčních poolů — pouze signály m/z 521 a 1042 ve frakci PSMA-617).

Praktická poznámka: při purifikacích bylo ukončení běhů před časem použito k úspoře času a přípravě kolony pro další injekce, což je běžná strategie v prep laboratoři.

Přínosy a praktické využití metody

• Inertní hardware a MaxPeak Premier HPS technologie snižují non-specific adsorption, zlepšují tvar píků (menší tailing), zvyšují plochu píků a zužují šířku píků—to vede k lepšímu frakcionování a vyšší čistotě izolátu.
• Focused gradient poskytl lepší rozlišení blízce elujících komponent než širší gradienty a umožnil efektivní přípravu materiálu pro následnou „polishing“ purifikaci.
• Schopnost prediktivního škálování analytických podmínek na preparativní úroveň zkracuje dobu vývoje metody, snižuje spotřebu rozpouštědel a zrychluje získávání materiálu vhodného jako referenční standard či pro další charakterizaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření použití inertních povrchových technologií (HPS/MaxPeak) při purifikaci kovově afinních molekul obsahujících chelátory (např. DOTA), peptidů či molekul s kyselými skupinami.
• Využití optimalizovaných focused gradientů a přesného řízení teploty (Timberline heaters) k zlepšení opakovatelnosti separací a dalšímu zkrácení doby sušení frakcí.
• Další integrace UPLC–MS analytiky s automatizovanými preparativními systémy pro rychlé obohacení a následné „polishing“ kroky vedoucí k úplné charakterizaci degradantů.
• Uplatnění podobných postupů při přípravě standardů pro regulaci kvality a při vývoji radioligandových léčiv, kde rychlost a účinnost purifikace ovlivňují praktickou použitelnost v klinických postupech.

Závěr

Studie demonstrovala efektivní workflow od nucené degradace přes analytické method screening až po preparativní izolaci PSMA-617 s využitím inertních kolon MaxPeak Premier a focused gradientu (45–54 % B). Metoda umožnila získat vysoce čistý PSMA-617 a obohacené frakce dvou blízce elujících nečistot, což usnadní následné čisticí kroky a strukturální identifikaci. Výhody inertního hardwaru a small-particle preparativních kol přispívají k rychlejší, udržitelnější a reprodukovatelnější purifikaci kritických prekurzorů v radioligandové terapii.

Reference

1. Giugliano F.; et al. Cancer Treatment Reviews. 136 (2025) 102940.
2. Berthelette K.; Aiello M.; Collins C.; Walter TH. Development of a UPLC Method for a Forced Degradation Study of Radioligand Therapy Precursor PSMA-617. Waters Application Note. 720009042, 2025.
3. DeLano M.; et al. Analytical Chemistry. 93 (2021) 5773-5781.
4. Xia J.; Jablonski J.; Shave D.; Lawrence K. Temperature Control Using Waters LC Purification Systems with Timberline’s Column and Mobile Phase Heaters: Optimizing Preparative Performance. Waters Application Brief: 720008874, 2025.
5. Fountain K.; Hewitson H.; Iraneta P.; Morrison D. Practical Applications of Charged Surface Hybrid (CSH) Technology. Waters Application Note: 720003720, 2010.
6. Jablonski J.; et al. Developing Focused Gradients for Isolation and Purification. Waters Application Note: 720002955, 2009.
7. Jablonski J. 5 Rules of Scaling LC Purification Rule 4. Leverage Identical Column Attributes and Similar L/dp Attributes. Waters Article: 720008383, 2024.