Identification and Quantification of Components of In-Vitro Transcription (IVT) Reaction in a Mixture Using Process Raman

Význam tématu

Rychlý rozvoj terapeutických a vakcinačních přípravků na bázi mRNA zvyšuje požadavky na přesné řízení výroby in vitro transkripcí (IVT). Klíčové komponenty IVT (rNTPs, modifikované rNTPs, kapovací analogy) určují výtěžek i kvalitu mRNA; jejich monitorování v reálném čase umožní optimalizaci spotřeby surovin, zamezení nežádoucích vedlejších produktů a potenciální zavedení řízené výroby (PAT). Tento dokument prokazuje průkaznou použitelnost procesní Ramanovy spektroskopie jako inline nástroje pro identifikaci a kvantifikaci těchto komponent v homogenní směsi.

Cíle a přehled studie

• Prokázat, že procesní Raman dokáže rozlišit základní rNTP (ATP, GTP, CTP, UTP), dvě modifikované báze (2‑Thio‑UTP, 5‑Me‑CTP) a kapovací analog ARCA v akvózním prostředí IVT.
• Vytvořit kvantitativní chemometrické modely (PLS) pro simultánní kvantifikaci těchto komponent v koncentracích relevantních pro IVT (0–10 mM).
• Ověřit, zda je možné rozpoznat a sledovat syntetizovanou mRNA v přítomnosti ostatních reaktantů.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: Thermo Scientific MarqMetrix All‑In‑One Process Raman Analyzer s mikro‑immerzním sondou pro měření malých objemů (vzorky v epruvetě, objem 1 mL pro standardní přípravky).
• Nastavení akvizice: laser 450 mW, integrační čas 3000 ms, průměrování 3 snímků.
• Příprava vzorků: individuální komponenty v tris‑acetát pufru 25 mM pH 7.9; referenční koncentrace pro jednotlivá měření 3 mM. Pro DoE směsi použit rozsah 0–10 mM (typický pro IVT).
• Předzpracování spekter: kombinace metod v závislosti na kroku analýzy — Automatic Whittaker Smoothing (AWS), Standard Normal Variate (SNV), odčítání průměru, normalizace na vodní pásmo (region 3080–3230 cm–1), Savitzky‑Golay filtr (1. nebo 2. derivace, pořad 2, okno 13) a škálování na střední hodnotu.
• Chemometrie: PCA pro vizuální rozlišení a identifikaci signatur; modelování kvantifikace pomocí PLS regresí (spektrální interval pro PLS 480–3240 cm–1). Datový split proveden Kennard‑Stone (70 % trénink / 30 % test) a interní cross‑validace Venetian blind. Software: SOLO 9.3.1.
• Design experimentu (DoE): Uniform design k vytvoření tréninkové množiny reprezentující rovnoměrně celé designové pole; 35 vzorků s náhodně rozloženými koncentracemi každé komponenty v rozmezí 0–10 mM.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikace komponent: jednotlivé rNTP, modifikované nukleotidy a ARCA vykazují odlišné Ramanovy pásy; PCA zřetelně separovala třídy v prostoru hlavních komponent, což potvrzuje možnost jejich identifikace v komplexním spektru směsi.
• Kvantifikace pomocí PLS: pro každý analyt byl vybudován samostatný PLS model s optimálním počtem latentních proměnných (obvykle 4–5 LV). Modely vykazovaly vysoké koeficienty determinace pro predikci (R² prediction): ATP 0.996, GTP 0.994, CTP 0.996, 5‑Me‑CTP 0.998, UTP 0.983, 2‑Thio‑UTP 0.986, ARCA 0.982.
• Přesnost a chybovost: RMSEP pro analyty se pohybovalo v rozmezí přibližně 0.16–0.44 mM (v rámci 0–10 mM designu), bias‑y byly blízké nule, RMSECV a RMSEC indikují dobrou shodu a nízké riziko přeučení díky CV metodám.
• Modelová specifita: VIP analýza ukázala, že modely využívají specifičtější Ramanovy posuny (VIP > 1) odpovídající molekulárním vibracím cílových sloučenin, což podporuje chemickou interpretovatelnost a nezávislost predikcí na nespécifických korelacích.
• Detekce mRNA: spektrální znak O‑P‑O vibrace kolem ~814 cm–1 u mRNA byla odlišná od signatur jednotlivých nukleotidů; mRNA připravená v koncentraci 2 mg/mL (2 μg/μL) vykazovala rozpoznatelný signál, což naznačuje možnost sledování syntézy mRNA během IVT. Naopak RNA polymeráza, DNA templát a některé enzymatické složky měly signál pod detekčním limitem zařízení v použitých koncentracích.

Přínosy a praktické využití metody

• Inline Raman představuje neinvazivní, rychlý a bezpreparátní PAT nástroj vhodný pro vodné systémy IVT díky nízkému vlivu vody na Ramanův signál a vysoké chemické specifičnosti.
• Možnost současné multi‑komponentní kvantifikace (rNTPs, modifikované rNTPs, ARCA) umožní řízené doplňování reaktantů, optimalizaci reakcí a snížení nákladů spojených s plýtváním drahými substráty.
• Rozpoznání mRNA přímo v reakční směsi otevírá cestu k monitorování průběhu syntézy a ke včasné detekci stagnací nebo nežádoucích produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Validace na reálných procesních datech: nutné je nasbírat inline Raman měření během skutečných IVT běhů, aby se modely robustně ověřily vůči procesní variabilitě (teplota, viskozita, přítomnost enzymů a produktů).
• Šíření modelu: rozšíření tréninkového datasetu o reálné časové řady a více výrobních podmínek umožní robustnější modely schopné rozlišit i nižší koncentrace a vedlejší produkty jako dsRNA.
• Integrace do řídicích smyček: s validovanými modely je možné zavést inline regulaci dávkování rNTP nebo ukončení reakce na základě koncentrací v reálném čase.
• Rozšíření analytického portfolia: kombinace Raman s jinými PAT (např. UV/Vis, HPLC off‑line potvrzení) pro komplexní QC a pro kvantifikaci složek s velmi nízkou koncentrací.
• Technologický vývoj: snížení detekčního limitu sondy, automatizace kalibrací a adaptivní předzpracování spekter zvýší citlivost a použitelnost v GMP prostředí.

Závěr

Tato proof‑of‑concept studie ukazuje, že procesní Ramanova spektroskopie dokáže v akvózním prostředí IVT identifikovat a kvantifikovat klíčové reaktanty (ATP, GTP, CTP, UTP, 5‑Me‑CTP, 2‑Thio‑UTP, ARCA) v rozsahu 0–10 mM s vhodnou přesností pro průmyslové aplikace. Modely PLS vykazují vysoká R² a nízké RMSEP, VIP analýza potvrzuje chemickou relevanci vybraných spektrálních pásem. Rozpoznání mRNA podle O‑P‑O pásu (~814 cm–1) naznačuje možnost sledování syntézy přímo v reakční směsi. Dalším krokem je nasazení a ověření modelů za skutečných podmínek IVT a následná integrace do operativního řízení procesu.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific MarqMetrix All‑In‑One Process Raman Analyzer
• Mikro‑immerzní Raman sonda pro měření drobných objemů (snímání v epruvetě / mikro‑objemu)
• Nastavení: 450 mW, 3000 ms integrace, 3 průměry
• Softwarové nástroje: SOLO 9.3.1 (chemometrie), standardní předzpracování (AWS, SNV, Savitzky‑Golay)

Reference

1. Kwon H.; Kim M.; Seo Y.; Moon Y. S.; Lee H. J.; Lee K.; Lee H. Emergence of Synthetic mRNA: In Vitro Synthesis of mRNA and Its Applications in Regenerative Medicine. Biomaterials 2018, 156, 172–193.
2. Mullard A. FDA Approves mRNA‑Based RSV Vaccine. Nat. Rev. Drug Discov. 2024.
3. Beck J. D.; Reidenbach D.; Salomon N.; Sahin U.; Türeci Ö.; Vormehr M.; Kranz L. M. mRNA Therapeutics in Cancer Immunotherapy. Mol. Cancer 2021, 20(1), 69.
4. Liu C.; Shi Q.; Huang X.; Koo S.; Kong N.; Tao W. mRNA‑Based Cancer Therapeutics. Nat. Rev. Cancer 2023, 23(8), 526–543.
5. Yamamoto A.; Kormann M.; Rosenecker J.; Rudolph C. Current Prospects for mRNA Gene Delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2009, 71(3), 484–489.
6. Abu‑Absi N. R.; Kenty B. M.; Cuellar M. E.; Borys M. C.; Sakhamuri S.; Strachan D. J.; Hausladen M. C.; Li Z. J. Real‑Time Monitoring of Multiple Parameters in Mammalian Cell Culture Bioreactors Using an In‑Line Raman Spectroscopy Probe. Biotechnol. Bioeng. 2011, 108(5), 1215–1221.
7. Esmonde‑White K. A.; Cuellar M.; Lewis I. R. The Role of Raman Spectroscopy in Biopharmaceuticals from Development to Manufacturing. Anal. Bioanal. Chem. 2022, 414(2), 969–991.
8. Esmonde‑White K. A.; Cuellar M.; Uerpmann C.; Lenain B.; Lewis I. R. Raman Spectroscopy as a Process Analytical Technology for Pharmaceutical Manufacturing and Bioprocessing. Anal. Bioanal. Chem. 2017, 409(3), 637–649.
9. Buckley K.; Ryder A. G. Applications of Raman Spectroscopy in Biopharmaceutical Manufacturing: A Short Review. Appl. Spectrosc. 2017, 71(6), 1085–1116.
10. Lee K. H.; Song J.; Kim S.; Han S. R.; Lee S.‑W. Real‑Time Monitoring Strategies for Optimization of in Vitro Transcription and Quality Control of RNA. Front. Mol. Biosci. 2023, 10.
11. Fang K.‑T.; Lin D. K. J.; Winker P.; Zhang Y. Uniform Design: Theory and Application. Technometrics 2000, 42(3), 237–248.
12. Zhang L.; Liang Y.‑Z.; Jiang J.‑H.; Yu R.‑Q.; Fang K.‑T. Uniform Design Applied to Nonlinear Multivariate Calibration by ANN. Anal. Chim. Acta 1998, 370(1), 65–77.
13. Stover N. M.; Ganko K.; Braatz R. D. Mechanistic Modeling of in Vitro Transcription Incorporating Effects of Magnesium Pyrophosphate Crystallization. Biotechnol. Bioeng.