Non-Targeted Analysis of Metabolites in Alcoholic Beverages Using LC-QTOFMS

Význam tématu

Nezaměřená (non-targeted) metabolomická analýza pomocí LC-QTOFMS umožňuje komplexní zjišťování malých molekul v potravinách bez předchozích předpokladů o tom, které sloučeniny jsou přítomny. To je v potravinářství klíčové pro odhalení rozdílů způsobených surovinami, výrobními postupy nebo prokazování autenticity a kvality výrobků. Přesné hmotnostní informace a MS/MS spektra získaná QTOF přístroji výrazně zvyšují šance na identifikaci a charakterizaci významných markerů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat použití non-targeted workflow pro rozlišení a identifikaci metabolitů v šesti typech pivních a pivním podobných nápojích (běžné pivo, ale i low‑malt, nealkoholické a sójou obohacené varianty). Autoři zkoumali schopnost softwaru provést detekci piků, jejich zarovnání mezi vzorky a následné hledání v MS/MS knihovně, aby bylo možné nalézt sloučeniny, které odrážejí rozdíly v surovinách a výrobních postupech.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Shimadzu Nexera X3, reverzní fáze, teplota kolony 40 °C.
• Mobilní fáze: 0,1 % kyseliny formiové ve vodě a 0,1 % kyseliny formiové v acetonitrilu; gradientní eluční režim.
• Chromatografie: průtok 0,25 mL/min, objem injekce 3 µL.
• MS: Shimadzu LCMS‑9030 (QTOF) s ESI, pozitivní ionizace; režim Data Dependent Acquisition (DDA), scanovací rozsah přibližně m/z 50–1000 pro MS a MS/MS.
• Kolizní energie: nastavená přibližně na 35 V s rozmezím ±17 V pro získání MS/MS spekter.

Použitá metodika

• Vzorky: šest komerčních „pivních“ vzorků (pivo, low‑malt, pivní nápoj, dvě nealkoholické varianty); předanalytická úprava spočívala v odplynění a 10× ředění ultrapure vodou.
• Analytický režim: LC‑QTOF v DDA pro současné získání precursorních i fragmentačních spekter za účelem následného vyhledávání v knihovnách.
• Softwarová analýza: LabSolutions Insight Profiler pro detekci piků, zarovnání mezi běhy, provázání chromatogramů a spekter a následnou multivariační analýzu (PCA, volcano ploty).
• Identifikace: porovnání MS/MS spekter s NIST 23 Mass Spectral Library (~50 000 slovních záznamů); skóre podobnosti určovalo míru shody spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekce a identifikace: softwarový workflow detekoval 4 695 chromatografických rysů (features). Z MS/MS hledání bylo nalezeno 403 shod s podobností ≥50, z toho 214 shod s podobností ≥80.
• Konkrétní ilustrace: rys s průměrným m/z 156.077 a retenční dobou ~1.9 min byl přiřazen jako L‑histidin se skóre podobnosti 83.
• Multivariační rozlišení: PCA (s Pareto škálováním) ukázala, že vzorky č. 1 (lager), č. 2 (ale) a č. 6 (nealkoholické pivo 2) tvoří skupinu s podobnými profilem metabolitů. Vzorky č. 3 (low‑malt) a č. 5 (nealkoholické pivo 1) se seskupily dohromady, zatímco vzorek č. 4 (pivní nápoj obsahující sóju) se jasně odlišil podél PC2.
• Markerové sloučeniny: ve vzorcích 1, 2 a 6 byly prominentní aminokyseliny (histidin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan) a nukleotidové metabolity (cytidin, guanosin). U těchto vzorků byl také detekován hordenin — alkaloid odvozený z ječmene. Vzorek 4 vykazoval přítomnost isoflavonů (daidzin, genistein), což odpovídá použití sójových surovin.
• Interpretace: podobnost profilů u vzorků 1, 2 a 6 se přičítá shodným surovinám a fermentačním postupům; nealkoholické pivo č. 6 má tedy podobný metabolický podpis, protože je vyráběno z pivních surovin s potlačením alkoholového výnosu.

Přínosy a praktické využití metody

• Autentifikace a kontrola surovin: schopnost odlišit výrobky na základě specifických metabolitů (např. izoflavony nebo hordenin) usnadňuje ověřování použitých surovin.
• Kontrola výrobního procesu: profily metabolitů odrážejí rozdíly v technologii výroby (fermentace, suroviny), což lze využít pro monitorování konzistence a optimalizaci receptur.
• Podpora vývoje produktů a senzorické korelace: identifikované markery lze propojit s organoleptickými vlastnostmi a nutričním profilem.

Omezení a poznámky k robustnosti výsledků

• Identifikace je závislá na kvalifikaci spektra v knihovně; bez komerčních standardů zůstávají některé přiřazení na úrovni pravděpodobné identifikace.
• Režim DDA může preferovat intenzivní ionty a opomenout řadu nízkointenzitních sloučenin; pro úplnější záznam mohou být výhodné metody jako DIA nebo vyšší hloubka frakcionace.
• Matrice piv je komplexní — matriční efekty a rozdílná ionizace ovlivňují kvantitativní srovnání; výsledky jsou tedy spíše relativní než absolutní koncentrace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšiřování a standardizace knihoven MS/MS spolu s metrologickými standardy povede k vyšší spolehlivosti identifikací.
• Integrace iontové mobility, datových přístupů jako DIA a strojového učení zlepší anotaci neznámých rysů a zvýší citlivost analýzy.
• Vyšší automatizace datových workflow a pokročilá vizualizace (propojení s sensory daty) umožní uplatnění v rutinní QA/QC i v rychlém vývoji nových produktů.
• Vytváření referenčních metabolomických profilů pro specifické kategorie nápojů/piv může podpořit detekci podvodů a diferenciaci geografického původu.

Závěr

Non‑targeted LC‑QTOFMS v kombinaci se softwarem pro automatizované zpracování dat dokáže efektivně detekovat tisíce rysů a identifikovat stovky kandidátních sloučenin v pivních vzorcích. Studie ukázala, že získané metabolické profily korelují se surovinami a výrobními postupy a mohou být využity při hodnocení kvality, autentifikaci a vývoji produktů. Pro definitivní potvrzení identit klíčových markerů je vhodné dodatečné ověření pomocí standardů a doplňkových analytických přístupů.

Reference

1. Iida T., Umakoshi Y., Kobayashi M. Non-Targeted Analysis of Metabolites in Alcoholic Beverages Using LC-QTOFMS. Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan. Poster (NIST 23 library referenced); data zahrnují použití Nexera X3 a LCMS-9030 a analýzu provedenou v LabSolutions Insight Profiler.