Advanced analytical technologies for rapid screening of process and product quality attributes supporting upstream bioprocessing

Význam tématu

Včasná a spolehlivá analytická informace z cultureních procesů je zásadní pro efektivní design–make–test cyklus v upstream bioprocessingu. Rychlé screeningové metody umožňují optimalizovat podmínky kultivace, sledovat klíčové parametry kvality produktu (CQA) a zkrátit čas potřebný pro rozhodování během vývoje. Integrace automatizované přípravy vzorků, rychlých LC/LC‑MS metod a softwarové vizualizace dat významně zvyšuje propustnost dat a opakovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentovaného posteru bylo popsat sadu rychlých analytických metod a pracovní postupy implementované v centru Waters Immerse Delaware pro podporu upstream vývoje. Hlavní body zahrnují automatizovanou přípravu vzorků, rychlé LC‑MS protokoly pro analýzu médií a metabolitů, měření titru pomocí ProA, hodnocení agregace pomocí SEC, analýzy intaktního a redukovaného proteinu a analýzu uvolněných oligosacharidů. Metody byly ověřeny na víceparalelním Ambr250 bioreaktoru v experimentech DOE.

Použitá metodika a instrumentace

V pracovním postupu se kombinovala automatizovaná příprava vzorků s rychlými chromatografickými a hmotnostními analýzami. Hlavní prvky metodiky:

• Automatizace přípravy: Andrew+ pipetovací roboti pro ProA zachycení, denaturaci, redukci a přípravu glykanů; minimalizace spotřeby vzorků (celkem ~150 µL pro média, 70 µL po ProA).
• Analýza médií a metabolitů: reversed‑phase LC‑MS na ACQUITY Premier HSS T3 (1.8 µm, 2.1×100 mm) s knihovnou >220 sloučenin; doba analýzy 9 min (pozitivní/negativní režim); mobilní fáze A = 0.1% FA, B = 90% ACN/10% IPA/0.1% FA.
• Měření titru: ProA affinity column 2.1×20 mm na ACQUITY Premier LC‑UV; doba 3 min; mobilní fáze A = 1×DPBS, B = 0.1% FA; detekce UV 280 nm.
• Agregace (SEC): screeningový SEC Premier 4.6×100 mm (250 Å) – isokratický běh v DPBS, 4 min; charakterizace na 4.6×300 mm, 15 min; detekce UV 280 nm; vzorky buď surová média nebo ProA‑purifikované.
• Intaktní protein (LC‑MS): ACQUITY Premier Protein BEH C4 2.1×50 mm (300 Å); doba 5 min; vysoká teplota kolony (80 °C) a standardní ACN/IPA/FA mobilní fáze; rozlišení intaktní hmotnosti a dekonvoluce spekter.
• Redukovaný protein: denaturace guanidinem a redukce DTT pro separaci HC/LC; stejná C4 kolona; doba 5 min.
• Uvolněné glykanové profily: Glycan BEH Amide 2.1×150 mm; příprava pomocí komerčních Glycan kitů na Andrew+ robotech; doba 10 min; mobilní fáze ammonium formát/ACN.
• Softwarová analýza: Waters add‑in pro JMP pro import, organizaci a vizualizaci trendů v čase (např. sledování aminokyselin přes 8 reaktorů po 14 dnech).

Použitá instrumentace

• Ambr® 250 multi‑parallel bioreactor (Sartorius) pro DOE incubace
• Andrew+ Pipette Robots pro automatizovanou přípravu vzorků
• ACQUITY UPLC / ACQUITY Premier systémy pro LC a SEC
• BioAccord LC‑MS (HRMS) pro intaktní a redukované proteiny, metabolity a glykanovou analýzu
• ProA affinity kolonky (2.1×20 mm) pro rychlé měření titru
• ACQUITY Premier HSS T3, Protein BEH C4, Glycan BEH Amide a Premier SEC kolony
• JMP (SAS) s Waters add‑in pro datové zpracování a vizualizaci

Hlavní výsledky a diskuse

Prezentované metody umožňují rychlou a citlivou charakterizaci klíčových atributů produktu i procesu s nízkým objemem vzorku a krátkými časy analýzy. Konkrétní výstupy:

• Rychlé zobrazení metabolitického profilu a trendování vybraných aminokyselin (např. glutamát) během inkubace pomocí LC‑MS s knihovnou 220+ sloučenin.
• Spolehlivé a krátké (3 min) měření titru mAb po ProA zachycení na LC‑UV.
• SEC screening v řádu minut pro sledování agregace přímo ze surového média; delší charakterizační metody poskytují detailnější rozlišení variant.
• Intaktní LC‑MS analýzy poskytují dekonvolvovaná spektra hmotností a rychlou detekci variací proteinu; redukované analýzy rozlišují HC/LC hmotnosti po DTT redukci.
• Uvolněné glykanové analýzy umožňují identifikaci dominantních glycans s krátkým časem běhu (10 min) při použití automatizované přípravy.

Diskuse zdůrazňuje výhodu společných mobilních fází mezi několika metodami (zjednodušení zásob a rychlejší přepínání metod) a přínos automatizace pro konzistenci vzorků a nízkou spotřebu objemu. Aplikace na Ambr250 ukázala, že rychlá analytika poskytuje včasnou zpětnou vazbu potřebnou pro rozhodování v DOE experimentech.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení throughputu analytiky v upstream vývoji díky kombinaci automatizace a krátkých běhů (minuty vs. hodiny).
• Úspora materiálu a času – nízké objemy vzorků a minimalizace ruční práce.
• Možnost častého monitoringu kritických parametrů procesu a produktu pro rychlé optimalizační cykly.
• Standardizace pracovních postupů a mobilních fází zjednodušují nasazení v rutinním provozu a mezi různými assay.
• Integrace s JMP umožňuje rychlé vizualizace trendů a podporuje rozhodování na základě víceatributových dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší integrace analytiky do strategií PAT (process analytical technology) s cílem směrovat proces na základě on‑line/off‑line dat v reálném čase.
• Další automatizace a miniaturizace přípravy vzorků pro ještě vyšší paralelitu a nižší spotřebu reagencií.
• Využití strojového učení a multivariační analýzy pro predikci kvality produktu z kombinovaných dat (metabolity, titer, glykanové profily, agregace).
• Rozšíření knihoven metabolitů a glykanových referencí pro širší pokrytí typů produktů a média.
• Vývoj robustnějších inline samplingových strategií pro přímé napojení bioreaktorů na analytické platformy.

Závěr

Soubor rychlých, vzájemně kompatibilních analytických metod implementovaných v Waters Immerse Delaware umožňuje efektivní a škálovatelný screening klíčových atributů produktu a procesu v upstream bioprocessech. Kombinace Andrew+ automatizace, rychlých LC/LC‑MS metod a softwarové podpory pro vizualizaci dat poskytuje praktický nástroj pro urychlení design–make–test cyklu a podporu rozhodování při optimalizaci procesů.

Reference

1. Alelyunas Y., Jeske R., Wushensky J., Przybylski C., Sanes J. Advanced analytical technologies for rapid screening of process and product quality attributes supporting upstream bioprocessing. Waters Immerse Delaware poster. NIIMBL Confidential.