Automated Amino Acid Derivatization and Sample Handling Workflow

Význam tématu

Automatizace přípravy vzorků pro stanovení aminokyselin řeší klíčové provozní problémy v analytických laboratořích: vysokou pracnost manuálních kroků (derivatizace, ředění, příprava kalibrací), variabilitu mezi operátory a časovou náročnost. Implementace injektorových pracovních postupů přímo v prostředí Chromatography Data System (Waters Empower) nabízí pragmatické a cenově přívětivé řešení, které umožňuje řídit přípravu vzorků bez nutnosti samostatných robotických systémů a současně uchovat stopovatelnost a kontrolu nad daty.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ukázat praktickou integraci Agilent 1260 Infinity III autosamplerů s Empower CDS pomocí WICF ovladačů tak, aby šlo v rámci jedné injekční sekvence automatizovat prekolonovou derivatizaci aminokyselin (OPA pro primární a FMOC pro sekundární aminokyseliny), ředění vzorků a přípravu kalibračních standardů. Studie demonstruje, že tento přístup s použitím AdvanceBio AAA kolon dosahuje vysoké citlivosti, přesnosti a reprodukovatelnosti při zkrácených časech analýzy (run < 20 min).

Použitá metodika

Metoda kombinuje prekolonovou derivatizaci OPA/FMOC provedenou injektorem s následnou chromatografickou separací na Agilent AdvanceBio AAA koloni (4.6 × 100 mm, 2.7 μm). Mobilní fáze A je založena na fosfát/borátovém pufru pH ~8.2, mobilní fáze B je organický mix acetonitril:methanol:voda 45:45:10. Pracovní podmínky zahrnují průtok 1.5 mL/min, objem injekce 1 μL, teplotu kolon 40 °C a celkový čas běhu ~18 min. Diodový pole-detektor (DAD) používá přepínanou vlnovou délku (typicky 338 nm pro OPA a ~262 nm pro FMOC), analogicky fluorescenční detektor mění excitaci/emisi (340/450 nm → 260/325 nm) v nastaveném čase po eluci poslední OPA‑derivatizované aminokyseliny (lysin) a před první FMOC‑derivatizovanou (hydroxyprolin).

Klíčové body přípravy reagensů a standardů:

• Derivatizační činidla OPA a FMOC dodávaná jako hotové roztoky; doporučuje se alikvotování do mikroinsertů (100 μL) a skladování v chladu; OPA a FMOC po otevření jsou stabilní přibližně 7–10 dní při vhodném skladování.
• Borátový pufr doplňován do autosampler vialu a vyměňován přibližně každé 3 dny.
• Injekční ředidlo: směs mobilní fáze A s malým množstvím H3PO4, skladovat při 4 °C.
• Kalibrační standardy: použití hotových Agilent standardů a interních standardů (např. norvalin, sarcosin) s přípravou pracovních i skladovacích roztoků v 0.1 N HCl.

Použitá instrumentace

Seznam použitých modulů Agilent 1260 Infinity III uvedený ve studii:

• Quaternary Pump (G5654A)
• Multisampler (G5668A) s 100 µL analytickou hlavou a 100 µL smyčkou
• Multicolumn Thermostat (G7116B)
• Diode Array Detector WR (G7115A) s biologickým 10 mm flow-cellem
• Fluorescence Detector Spectra (G7121B) s 8 µL bio-inertním FLD flow-cellem (G1321-60005)
• Agilent InfinityLab Assist (G7180A) pro přípravu roztoků (softwarová podpora)

Řízení a automatizace:

• Waters Empower CDS 3 WICF 4.0 – komunikace s Agilent přístroji a konfigurace injektorových pracovních postupů (injector workflows) pro automatizovanou derivatizaci a manipulaci se vzorky.

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizované injektorové workflowy úspěšně provedly prekolonovou derivatizaci OPA/FMOC v rámci jedné injekční sekvence bez potřeby externího liquid handleru. Hlavní poznatky:

• Analýza 23 aminokyselin byla dosažena během ~18 min s dostatečným rozlišením; přepnutí detekčního režimu (DAD/FLD) udrželo obě skupiny derivátů v jednom chromatogramu.
• Reprodukce: překrytí šesti injekcí ukázalo velmi konzistentní chromatogramy (nízká variabilita retenčních časů a ploch), což dokládá vysokou opakovatelnost metody.
• Plněním požadavků farmakopey: např. separation Leu/Ile překročilo požadované minimum (uvedená resoluce 6.7 vs požadavek ≥1.5 dle Ph. Eur.).
• Praktické výhody: méně manuálních kroků, rychlejší nastavení metody než u konvenčního injector programu a snížení rizika lidské chyby.

Diskuse zdůrazňuje, že integrace do Empower CDS zajišťuje plnou stopovatelnost kroků a jednoduché opakování metody mezi operátory a laboratořemi.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí konkrétní přínosy pro farmaceutické a biotechnologické laboratoře:

• Automatizace bez nutnosti samostatných robotických stanic – nižší pořizovací náklady a jednodušší implementace.
• Vysoká opakovatelnost a menší operátorská variabilita vhodné pro rutinní QC stanovení.
• Rychlé throughput – pod 20 minut na vzorek umožňuje vyšší denní kapacitu laboratoře.
• Kompatibilita s existujícími Agilent kolony a komerčními standardy, čímž se zjednodušuje validace a nasazení.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího rozvoje a uplatnění zahrnují:

• Rozšíření injektorových workflowů na jiné prekolonové chemie či polarizované derivatizace včetně adaptace na různé typy vzorkových matic (matečná voda, potravinářství, bioprocesy).
• Integrace s hmotnostní spektrometrií (LC‑MS) pro zvýšení selektivity a identifikace neznámých komponent.
• Automatizovaná správa laboratorních skladů reagencií a prediktivní plánování výměny činidel na základě stability (snížení plýtvání činidly jako OPA/FMOC).
• Vyšší míra digitalizace: napojení workflowu do LIMS a využití inteligentních algoritmů pro optimalizaci rozvrhu běhů a údržby kolony.
• Miniaturizace ředicích kroků a spotřebního materiálu pro nižší náklady na spotřební zboží a menší potřebu chladicího prostoru.

Závěr

Studie prokazuje, že injektorové workflowy řízené přes Waters Empower v kombinaci s Agilent 1260 Infinity III přístroji a AdvanceBio AAA kolonami představují efektivní, reprodukovatelný a prakticky proveditelný přístup k automatizované derivatizaci a přípravě vzorků pro aminokyselinovou analýzu. Řešení zkracuje čas přípravy, snižuje operátorskou variabilitu a udržuje vysokou analytickou kvalitu bez nutnosti externí automatizace.

Reference

1. Schipperges S. Comparison of Plant‑Based Meat Alternatives and Meat. Agilent Technologies application note, publication number 5994-5950EN, 2023.
2. Schipperges S. Let Your Autosampler Do Your Pipetting. Agilent Technologies technical overview, publication number 5994-1704EN, 2020.
3. European Pharmacopoeia 9.0 (2.2.56) Amino Acid Analysis.
4. Amino Acid Analysis: How‑To Guide. Agilent Technologies technical overview, publication number 5991-7694EN, 2017.
5. John W. H.; Robert D. R.; Brian A. B.; Cliff W. Rapid, Accurate, Sensitive, and Reproducible HPLC Analysis of Amino Acids. Agilent Technologies application note, publication number 5980-1193EN, 2008.
6. William L. Automated Amino Acid Analysis Using an Agilent Poroshell HPH‑C18 Column. Agilent Technologies application note, publication number 5991-5571EN, 2015, 2017.