Comprehensive analysis of nucleic acids across a wide size range using a monodisperse reversed-phase particle platform

Význam tématu

Analytika nukleových kyselin je klíčová pro vývoj a kontrolu kvality moderních oligonukleotidových léčiv (siRNA, ASO, sgRNA, mRNA). Rozsah molekulárních velikostí od krátkých syntetických oligonukleotidů po tisícibasové mRNA klade zvýšené nároky na chromatografické metody: kolony optimalizované pro malé sekvence často ztrácejí výkon pro velké molekuly a naopak. Univerzální, reprodukovatelná platforma pro separaci napříč tímto rozsahem usnadní charakterizaci, sledování nečistot, kontrolu za procesu a podporu regulačních požadavků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikativní poznámky bylo vyhodnotit novou reverzní-fázovou kolonu SurePac Oligo RP MDi (2,5 µm monodisperzní supermacroporézní polymerové částice, SMP) jako univerzální řešení pro separaci nukleových kyselin v rozsahu ~10–>1 000 nukleotidů. Studie porovnávala tuto kolonu s DNAPac RP (4 µm polymerní) a s dalšími komerčními C18 kolonami (Vendor A, Vendor B) z hlediska rozlišení, tvaru píků, kapacity, kompatibility s různými ion-párovacími systémy a opakovatelnosti mezi šaržemi.

Použitá metodika a instrumentace

• Stacionární fáze: SurePac Oligo RP MDi, 2,5 µm monodisperzní SMP s kontinuálním rozdělením pórů (malé i velké póry v jedné částici) a inertním povlakem v těle kolony pro minimalizaci sekundárních interakcí.
• Porovnávací kolony: DNAPac RP (4 µm polymerní), Vendor A (C18 1,7 µm, 130 Å a 300 Å), Vendor B (C18 2,7 µm, 100 Å).
• Systémy LC a detekce: Thermo Scientific Vanquish Neo / Vanquish Horizon UHPLC systémy; Vanquish Diode Array Detector HL (UV 260 nm) a LightPipe flow cell 10 mm; Vanquish Neo pro LC–MS párováno s Orbitrap Ascend Tribrid MS (negativní ionizace, vysoké rozlišení 240k).
• MS software a zpracování: Xcalibur, FreeStyle SP3, BioPharma Finder (sliding-window dekonvoluce), Chromeleon CDS pro akvizici.
• Ion-párovací systémy testované: TEAA/ACN, hexylammonium acetate (HAA)/ACN, volatilní HFIP/DBA/methanol pro LC–MS kompatibilitu.
• Vzorky: 8-komponentní ssDNA mix (12–40 mer), siRNA kontrola 21 bp, sgRNA ~100 nt, 98–100 mer ssDNA mix, tRNAPhe (~76 nt), dsDNA digest phiX174 (72–1353 bp), mRNA 1 960 nt (firefly luciferase) a 3 500 µg/mL mRNA z formulace.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozlišení malých oligonukleotidů: SurePac Oligo RP MDi dosahuje ekvivalentních nebo ostřejších píků pro 12–40 mer ssDNA a lepší separace než DNAPac RP a další testované C18 kolony. Šíře retenčního okna byla širší, což indikuje dobrou kapacitu pro malé nukleotidy.
• siRNA analýza: Vyšší počet rozlišených nečistot, lepší oddělení antisense/sense a obecně odlišná selektivita; důležité pro sledování procesních nečistot a stability.
• Středně dlouhé oligonukleotidy (~100 nt): Kolona rozlišila 98/99/100 mer ssDNA s jasným peak-to-valley, kde ostatní kolony vykazovaly snížené nebo žádné rozlišení. sgRNA vykázalo detailnější profil nečistot.
• Velké nukleové kyseliny (dsDNA digest, mRNA ≈1 960 nt): SurePac Oligo RP MDi poskytla lepší separaci a tvary píků než DNAPac RP a jiné C18 kolony; jiné kolony selhávaly nad ~310 bp. Kolona má přístupné velké póry zajišťující hmotnostní transport pro velké molekuly.
• Mobilní fáze a MS kompatibilita: Kolona dobře pracuje s TEAA/ACN i HAA/ACN; pro LC–MS byla úspěšně použita volatilní HFIP/DBA/methanol, přičemž byla zachována symetrie píků a rozlišení. Byla provedena LC–MS analýza tRNAPhe s opakovatelným detekováním 10 intaktních stavů a monoisotopickou přesností ≤1 ppm pro hlavní spektra.
• Provozní vlastnosti: Nižší provozní tlak než u některých komerčních C18 kolon (výhoda pro volbu přístroje a rychlé QC metody). Nízký carryover pro mRNA (~1%).
• Reprodukovatelnost: Dobrá lot-to-lot a column-to-column konzistence pro 8-kombo ssDNA metodu, s minimálními odchylkami v retenčních časech a šířce píků.

Přínosy a praktické využití metody

• Jedna kolona pokrývá široké spektrum analytických aplikací od krátkých oligonukleotidů po dlouhé mRNA, což snižuje potřebu držet více typů kolon v laboratoři.
• Vysoké rozlišení umožňuje spolehlivou detekci truncací a blízce příbuzných variant (např. rozdíl o 1 nt) — užitečné pro kvalitu, stabilitu a procesní monitoring.
• Kompatibilita s volatilními ion-páry umožňuje přímé LC–MS workflow pro identifikaci a kvantifikaci modifikací, heterogenit a intaktních stavů.
• Nižší tlak a konzistentní výrobní vlastnosti usnadňují přenos metod mezi pracovišti a provozní integraci v rutinních QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rostoucí složitost oligonukleotidových terapeutik (konjugáty, dlouhé mRNA, modifikované RNA) zvýší poptávku po univerzálních, MS-kompatibilních chromatografických platformách jako je SurePac Oligo RP MDi.
• Další optimalizace ion‑párovacích systémů a organických modifikátorů pro zvýšení citlivosti MS a selektivity separace bude podporovat širší nasazení v charakterizaci post-translačních či chemických modifikací.
• Možnosti škálování metod pro vysokopropustné QC prostředí a integrace s automatizovanými LC–MS pracovišti pro komplexní profiling produktů a nečistot.

Závěr

Studie ukazuje, že SurePac Oligo RP MDi kolona s 2,5 µm monodisperzními SMP částicemi nabízí vyváženou porézní architekturu umožňující vysoké rozlišení a dobrý hmotnostní transport napříč širokým rozsahem velikostí nukleových kyselin. Kolona překonává nebo se vyrovná existujícím polymerním a C18 materiálům v oblasti rozlišení, má nižší provozní tlak, je kompatibilní s MS‑přátelskými mobilními fázemi a vykazuje robustní lot‑to‑lot reprodukovatelnost — to vše činí z této platformy praktické řešení pro analytiku oligonukleotidů v R&D i QC prostředích.

Reference

• Thermo Fisher Scientific. Application note AN004530, Oligo analysis — Comprehensive analysis of nucleic acids across a wide size range using a monodisperse reversed-phase particle platform. 2026.
• Instrumentace a reaktanty citované v aplikaci: Vanquish Neo/Horizon UHPLC, Vanquish DAD HL, Orbitrap Ascend Tribrid MS, BioPharma Finder, Chromeleon; ion-páry TEAA, HAA, HFIP/DBA; různí dodavatelé oligonukleotidů a standardních markerů.