From Extractables Screening to Targeted Leachables Quantitation Using DDA and Tof- MRM on the Xevo™ MRT Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza extractables a leachables (E&L) z farmaceutických obalů a zdravotnických prostředků je klíčová pro posouzení bezpečnosti pacientů. Nízké hladiny migrujících chemikálií vyžadují citlivé a selektivní analytické metody. Kombinace kvalitativního screeningu a následné cílené kvantifikace na jedné platformě zjednodušuje workflow, snižuje riziko chyb při přenosu dat a zlepšuje konzistenci výsledků pro toxikologické hodnocení a shodu s normami.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo ukázat postup, kde data dependent acquisition (DDA) slouží k získání čistých, prekurzoru-specifických MS/MS spekter pro výběr fragmentů, které jsou následně použity k sestavení cíleného kvantitativního protokolu v režimu time-of-flight MRM (Tof-MRM) na hmotnostním spektrometru Xevo MRT. Studie demonstruje, že jedno high-resolution MS (HRMS) zařízení může pokrývat jak screening extractables, tak citlivou kvantifikaci leachables srovnatelnou s triple‑quad přístupy.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: komerční nosní sprej (roztok 1:10 v isopropanolu) extrahovaný kontejner/uzávěr; dořezy spiknuty E&L SST mixem.
• Chromatografie: ACQUITY Premier, kolona CORTECS C18 2.1×100 mm, 1.6 µm, 90 Å, teplota 50 °C, injekce 1 µL, tok 0.3 mL/min. Mobilní fáze A: voda + 1 mM NH4OAc + 0.1 % HCOOH; B: methanol. Gradient: 2 % B 0–0.5 min → 98 % B do 6.0 min, držení 7 min, návrat a reequilibrace.
• MS: Xevo MRT Mass Spectrometer; ESI pozitivní/negativní; rozmezí m/z 50–1200; zdroj 120 °C; desolvace 550 °C, 800 L/h; kapilární napětí 2.5 kV; cone 40 V; kolizní energie ramp 10–75 eV.
• DDA nastavení: survey scan 10/20 Hz, MS/MS 20/50 Hz, top 10 iontů, switch na MS/MS při intenzitě >20 000 cps, návrat při <10 000 cps nebo po 3 s, CE ramp 10–75 V přes celé m/z okno.
• Tof-MRM s EDC (enhanced duty cycle): cílené přechody odvozené z DDA fragmentů, plánované (scheduled) skeny pro vyšší citlivost.
• Software: waters_connect platforma s UNIFI a MS Quan aplikacemi (včetně nástroje standard addition).

Hlavní výsledky a diskuse

• DDA poskytl vysoce specifická MS/MS spektra s hmotnostnou přesností ≤1 ppm (RMS) napříč analyty a injekcemi.
• Srovnání DDA vs MSE (DIA) ukázalo významné snížení počtu neatribuovaných fragmentních píků: u Cyasorb 2908 se počet píků ve spektru snížil o ~33 %; ve spiknuté matrici až o ~48 %. To zvyšuje jistotu při výběru specifických fragmentů pro kvantifikaci.
• Tof-MRM s EDC přinesl výrazné zvýšení využití iontů (prakticky téměř 100 % v cílovém m/z rozsahu), což vedlo k vysoké citlivosti kvantifikace.
• Lineárnost a citlivost: pro Cyasorb 2908 byla kalibrace lineární v rozmezí 0.01–100 ng/mL s R2 = 0.999; limit kvantifikace byl demonstrativně 0.01 ng/mL (S/N = 19).
• Přesnost kvantifikace ve spiknutých vzorcích: Cyasorb 2908 změřen 9.39 ng/mL (vs oček. 10 ng/mL); Irganox 1076 s aplikací standard addition 10.7 ng/mL (vs oček. 10 ng/mL). Hodnoty byly v rozmezí ±10 % od deklarovaných koncentrací.
• Praktický problém: přítomnost E&L stop v blank vzorcích; pokud není možný skutečný blank, MS Quan standard addition workflow umožňuje korekci pozadí pro spolehlivou kvantifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost provádět jak screening (identifikaci), tak následnou cílenou kvantifikaci na jedné HRMS platformě zjednodušuje laboratořní workflow a zrychluje přechod od objevu k kvantifikaci.
• DDA usnadňuje výběr vysoce specifických fragmentů, což zvyšuje selektivitu Tof-MRM přechodů a snižuje interferenci z matrice.
• Tof-MRM s EDC přináší citlivost srovnatelnou s triple‑quad systémy, přičemž si zachovává výhody vysoké hmotnostní přesnosti a rezoluce HRMS (lepší identifikační jistota).
• Integrované softwarové nástroje (UNIFI, MS Quan) umožňují hladký přechod od akvizice dat k vyhodnocení, kalibraci a použití standard addition pro reálné vzorky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rostoucí adopce HRMS Tof‑MRM pracovních postupů pro regulované E&L analýzy s cílem konsolidovat nástroje pro screening i kvantifikaci.
• Vytváření standardizovaných knihoven DDA‑odvozených přechodů pro běžné E&L látky, které zrychlí sestavení cílených metod.
• Další optimalizace EDC režimů a synchronizace akvizice pro zvýšení citlivosti u širšího rozsahu molekul (včetně polárních a termolabilních látek).
• Integrace pokročilé automatizace zpracování dat a statistické kontroly kvality do UNIFI/MS Quan pro robustnější rutinní nasazení v QA/QC prostředí.
• Regulatorní validace HRMS‑Tof‑MRM postupů a jejich akceptace jako alternativy k tradičním triple‑quad metodám pro některé třídy analytů.

Závěr

Demonstrace workflow DDA → výběr specifických fragmentů → plánované Tof‑MRM s EDC na Xevo MRT ukázala, že jedna HRMS platforma může efektivně kombinovat identifikaci extractables a citlivou kvantifikaci leachables. Metoda přinesla vysokou selektivitu MS/MS spekter, vynikající lineárnost a nízké limity kvantifikace, s naměřenými hodnotami ve spiknutých vzorcích v rámci ±10 % očekávaných koncentrací. Použití standard addition umožnilo řešit problém pozadí v případech, kdy není dostupný „čistý“ blank.

Reference

1. USP–NF/PF. Assessment of Drug Product Leachables Associated with Pharmaceutical Packaging/Delivery Systems, USP <1664>.
2. USP–NF/PF. Assessment of Extractables Associated with Pharmaceutical Packaging/Delivery Systems, USP <1663>.
3. Norwood D.; et al. Chemical characterization relevant to extractables/leachables. Pharmaceutical Research, 2008;25:727–739.
4. ISO 10993‑18:2020. Biological evaluation of medical devices — Part 18: Chemical characterization of medical device materials within a risk management process.
5. Daly M.; Gethings L.; Hughes C.; Lock R.; Syed N. Tof‑MRM for the quantification of peptide biomarkers in human glioblastoma with the Xevo MRT Mass Spectrometer. Waters Application Note 720008972, 2025.
6. Tomcyzk N.; Wallace A.; Richardson K.; Grzyb A.; Wildgoose J. Targeted High Resolution Quantification with Tof‑MRM and HD‑MRM. Waters Application Brief 720004728, 2013.
7. Sanig R.; Kirk J.; Gethings L.; Lock R. Increased Identification Confidence for Extractables Screening Using the Xevo MRT Mass Spectrometer. Waters Application Note 720008970, 2025.