A Total Solution for the Quantitative Analysis of Benzocaine Metabolites in Fish Tissue

Význam tématu

Používání caine‑anestetik (např. benzokain) v akvakultuře může vést k přítomnosti reziduí a jejich metabolitů v jedlém mase ryb. Metabolity mohou přetrvávat i v případech, kdy mateřská látka není detekovatelná, proto je jejich monitorování kritické pro bezpečnost potravin a pro plnění regulatorních požadavků. Analytická výzva spočívá v detekci stopových množství polárních metabolitů v tukově bohatých matricích; LC‑MS/MS nabízí citlivost a selektivitu potřebnou pro spolehlivé stanovení v takovýchto matricích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a ověřit kompletní, produkčně použitelný LC‑MS/MS pracovní postup pro kvantitativní stanovení tří metabolitů benzokainu (PABA, AcPABA, AcBZ) v tkáni treskovitých a ostatních komerčních ryb. Metodika kombinuje standardizovanou extrakci QuEChERS, selektivní odstranění lipidů pomocí Captiva EMR–Lipid passthrough, chromatografické rozdělení na C18 sloupci a citlivou detekci na triple quadrupole MS; validace proběhla na třech typech ryb s nízkým, středním a vysokým obsahem tuku (tilapie, mořský okoun, norský losos).

Použitá metodika a instrumentace

Metoda extrakce a přípravy vzorku:

• 5 g homogenizovaného rybího masa smíchaných s 10 mL vody, přidání 10 mL acetonitrilu a QuEChERS EN extrakčních solí.
• Mechanické protřepání, centrifugace (5 000 rpm, 5 min).
• 4 mL supernatantu smíchaného s 1 mL vody a průchod přes Captiva EMR–Lipid HF kartu pro pasážový cleanup (bez evaporace a rekonstituce).
• Celkový čas přípravy: přibližně 25–30 minut na šarži 10 vzorků; minimalizované manipulační kroky zvyšují průchodnost.

Příprava kalibrací a kontrol:

• Individuální standardy v MeOH (1 mg/mL), mezistupeň 1 µg/mL v 80 % ACN/voda; devět hladin kalibrace 0,1–100 µg/L (ppb).
• Matrix‑spiked QC na třech úrovních: 1, 5 a 10 µg/kg (odpovídá ~0,4; 2; 4 µg/L v konečném extraktu).

Použitá instrumentace

• Liquid chromatograph: Agilent 1290 Infinity III.
• Kolona: Agilent Altura ZORBAX Eclipse Plus C18, 2.1 × 100 mm, 1.8 µm.
• Mobilní fáze: A = 0,05 % kyseliny mravenčí ve vodě; B = acetonitril; průtok 0,25 mL/min; objem injekce 2 µL; teplota kolony 30 °C; celková doba analýzy ~10 min (včetně post‑run).
• Hmotnostní spektrometr: Agilent 6495D triple quadrupole s Agilent Jet Stream zahřívaným ESI zdrojem; pozitivní ionizace, režim dynamického MRM (dMRM).
• Typické zdrojové parametry: teplota plynu ~290 °C, sheath gas ~330 °C, kapilární napětí ~3 500 V, nozzle ~1 500 V; dynamické časování eventů pro vyloučení odpadů mimo dobu analýzy.
• Software: Agilent MassHunter pro akvizici a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Linearity a přesnost: Kalibrace v rozmezí 0,1–100 µg/L vykazovala vynikající linearitu (R2 > 0,999) pro všechny tři analyty; přesnost 80–120 % napříč hladinami; žádný carry‑over po injekci nejvyššího standardu.
• Citlivost: Instrumentální MDL/IDL na úrovni ppt; IDL se pohybovaly přibližně 0,004–0,008 µg/L, MDL ~0,01–0,02 µg/L. V přepočtu na tkáň odpovídají MDL ~0,02–0,05 µg/kg.
• Matrix‑efekt: Hodnoty ME % byly v rozmezí 93–110 % (v rámci kritéria 80–120 %), což potvrzuje účinnost Captiva EMR Lipid při odstraňování tukových interferencí a minimální iontové supresi/enhance.
• Recovery a opakovatelnost: Matricově spike recoveries 80–120 % ve všech třech typech ryb a na všech QC úrovních; %RSD recoveries < 3 % pro většinu případů. Výjimkou bylo PABA při nejnižší QC (1 µg/kg) v lososu, RSD 7 %, nicméně stále v souladu s CODEX kritériem ≤ 20 %.
• Chromatografie: Dobrý separační výkon a symetrické, ostře tvarované píky během ~10 minut; Altura Ultra Inert povrch omezil sekundární interakce s polárními analyty, zlepšil tvar píku a integraci.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní, komerčně dostupné řešení vhodné pro rutinní monitorování reziduí v akvakultuře; laboratorně připravený workflow umožňuje rychlou implementaci bez rozsáhlého vývoje metody.
• Minimalizace pracovních kroků díky pasážovému EMR cleanupu (žádná evaporace/rekonstituce) zvyšuje throughput a snižuje riziko ztrát analyz.
• Vysoká citlivost a přesnost umožňují spolehlivé stanovování metabolitů na úrovních relevantních pro kontrolu potravinové bezpečnosti a pro potřeby dozoru trhu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření pracovního postupu na další caine‑třídu látek a jejich metabolity v různých potravinových matricích.
• Integrace stabilně značených interních standardů pro další zvýšení kvantitativní přesnosti a kompenzaci matrice‑efektů.
• Automatizace přípravy vzorků a škálování na vyšší kapacity pro komerční kontrolní laboratoře.
• Možnost přenosu metody na HRMS pro screening neznámých metabolitů nebo pro retrospektivní analýzy.
• Využití dat pro stanovování regulačních limitů (MRL) a pro širší monitorovací programy v akvakultuře.

Závěr

Popisovaný Agilent pracovní postup kombinuje rychlou QuEChERS extrakci, selektivní Captiva EMR–Lipid cleanup, efektivní chromatografii na Altura ZORBAX C18 a citlivou detekci na 6495D triple quadrupole. Metoda dosahuje vynikající linearity, ppt‑úrovňových MDL, spolehlivých recoveries (80–120 %) a vysoké opakovatelnosti (%RSD obvykle < 3 %). Díky těmto parametrům je postup vhodný pro rutinní a regulační analýzy metabolitů benzokainu v tukových i netukových rybích matricích.

Reference

1. Priborsky J., Velisek J. A Review of Three Commonly Used Fish Anesthetics. Reviews in Fisheries Science & Aquaculture, 2018, 26(4), 417–442. DOI: 10.1080/23308249.2018.1442812.
2. Lin S., Qiu W., Hua Y., Yang Y. Rapid Determination of Caine‑Based Anesthetics and Their Metabolite Residues in Fish Using a Modified QuEChERS Method Coupled with UPLC‑MS/MS. Food Chemistry: X, 2024, 24, 102032. DOI: 10.1016/j.fochx.2024.102032.