A Biological Model of the Ageing Metabolome Reveals Potential Clinically Relevant Biomarkers

Význam tématu

Studium změn metabolomu při buněčném stárnutí nabízí cenné poznatky o biochemických mechanismech stárnutí a potenciálních biomarkerech klinického významu. Untargeted metabolomika umožňuje komplexní zachycení malých molekul v buňkách a jejich extracelulárním prostředí, což je klíčové pro identifikaci signatur spojených se senescencí, dysfunkcí mitochondrií, změnami v mezibuněčné komunikaci a dalšími procesy spojenými se stárnutím.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo aplikovat end-to-end workflow pro nekontrolovanou (untargeted) metabolomiku k porovnání metabolomů lidských fibroblastů (HFF-1) a jejich kultivačního média mezi časným (passage 3) a pozdním (passage 20) průchodem buněk reprezentujícím senescentní stav. Studie použila HILIC chromatografii v kombinaci s QTOF hmotnostním spektrometrem v režimu DIA-MS/MS pro akvizici dat, následné zpracování pomocí MS-DIAL a statistickou analýzu v MetaboAnalystu a identifikaci metabolitů v LabSolutions Insight Explore.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: UHPLC Nexera X2 se Sloupcem Shim-pack Velox HILIC (2.1×100 mm, 2.7 µm), teplota 40 °C.
• Mobilní fáze: A = voda + 10 mM amonný formiát + 0.1 % kyseliny mravenčí; B = acetonitril:voda (92:8) + 10 mM amonný formiát + 0.1 % kyseliny mravenčí.
• Gradient: začátek 98 % B, přechod na 65 % B k 11 min, do 10 % B 12.5–14 min, re-equilibrace do 18 min; tok 0.3 mL/min (s přechodem na 0.4 mL/min v 13–17 min), injekce 0.5 µL, autosampler 4 °C.
• Hmotnostní spektrometr: Shimadzu LCMS-9030 Q-TOF. ESI +: 1.5 kV, ESI -: -3.0 kV; rozhraní 300 °C, heat block 400 °C, DL 250 °C; plyny: nebulizing 3 L/min, heating 10 L/min, drying 15 L/min; CID tlak 230 kPa.
• Akvizice: TOF-MS rozsah m/z 60–1000; DIA-MS/MS: 27 oken, m/z 40–1000, přibližné izolace prekurzoru 35 Da, collision energy spread 5–55 V; celkový cyklus ~0,991 s.
• Vzorky: extrakty buněk HFF-1 a kultivační média, analyzované separátně; každý typ vzorku v náhodném pořadí; porovnání passage 3 vs passage 20.

Data processing a statistika

• Feature detection a alignment: MS-DIAL četl LabSolutions RAW soubory přímo; použita dekonvoluce DIA-MS/MS pro přiřazení fragmentů k prekurzorům.
• Filtrace: ponechány rysy přítomné alespoň v 80 % vzorků v rámci jedné skupiny (passage 3 nebo 20); IQR filtrace (výchozí 40 %) k odstranění konstantních rysů; chybějící hodnoty nahrazeny 1/5 minimální kladné hodnoty proměnné.
• Statistika: MetaboAnalyst, volcano analýza s kritérii fold change >2 a p < 0,05 (passage 20 vs passage 3).
• Identifikace: LabSolutions Insight Explore pro automatické vyhledávání v knihovnách (MassBank, HMDB, NIST), možnost vytvoření interních knihoven; úroveň identifikace podle MSI: úroveň 1 (porovnání se standardem) nebo úroveň 2 (shoda se spektrem v databázích).

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza odhalila řadu metabolitů změněných při přechodu do senescentního stavu (passage 20) jak v buněčných extraktech, tak v médiu. Mezi významné zjištěné změny patří:

• Příklady signifikantně alterovaných metabolitů v buněčných extraktech (MSI úroveň 1 nebo 2): N8-acetylspermidin, spermidin, serin, řada lyzo-fosfatidylcholinů (např. LPC 18:0, LPC 16:0), palmitoyl- a stearoyl-karnitin, adenosin, adenín, kynurenin, dimethylglycin, muramová kyselina, cytidin, taurín a cytosin. Taurin byl konkrétně nalezen snížený v passage 20 vs passage 3.
• Příklady signifikantně změněných metabolitů v médiu: sn-glycerol-3-fosfát, ribóza-5-fosfát, inosín, uracil, alfa-ketoglutarát, sn-glycero-3-fosfocholín, N8-acetylspermidin, cystathionin a cytosin.
• Volcano ploty ukázaly kombinaci metabolitů zvýšených a snížených v senescenci; změny zahrnovaly jak polaritu střední velikosti (aminokyseliny, nukleotidy), tak lipidové deriváty (lyso-PC, acylkarnitiny), což naznačuje vícečetné metabolické posuny v energetickém metabolismu, fosfolipidové dynamice a polyaminových cestách.
• DIA-MS/MS přístup s dekonvolucí umožnil získat fragmentační informace pro všechny detekované rysy, což zlepšilo možnost ověření identit přes knihovny a umožnilo dosažení MSI úrovně 1 pro některé položky (např. taurín).

Přínosy a praktické využití metody

• End-to-end workflow poskytuje flexibilní, reprodukovatelný přístup pro nekontrolovanou metabolomiku buněčných systémů a média.
• DIA-MS/MS kombinované s HILIC separací poskytuje široké pokrytí polárních metabolitů a současně sbírá fragmentační data pro pozdější bibliografickou identifikaci.
• Kompatibilita s populárními open-source nástroji (MS-DIAL, MetaboAnalyst) a proprietárním LabSolutions Insight Explore usnadňuje kombinaci volně dostupných analytických nástrojů s robustní identifikací přes knihovny.
• Identifikované metabolity (např. polyaminy, acylkarnitiny, nukleotidy, taurín) jsou kandidáty na další validační studie jako potenciální biomarkery stárnutí nebo senescence v kultivačních modelech a eventuálně v klinických vzorcích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Validace kandidátních biomarkerů v širších biologických souborech a klinických kohortách včetně kvantitativních (targeted) metod pro přesnou koncentraci.
• Integrace s ostatními omickými daty (transkriptomika, proteomika) pro lepší mechanistické pochopení pozorovaných změn.
• Využití rozšířených knihoven MS/MS, zlepšení kvality knihoven a sdílení interních standardů pro zvýšení počtu MSI úrovně 1 identifikací.
• Aplikace vyššího rozlišení separace (ion mobility, multidimenzionální chromatografie) a rychlejších akvizičních režimů pro zvýšení průchodnosti a hloubky pokrytí metabolomu.
• Standardizace pracovních postupů a kritérií filtrace/normalizace napříč laboratořemi pro lepší reprodukovatelnost a srovnatelnost dat.

Závěr

Prezentované workflow HILIC + DIA-QTOF se ukázalo jako efektivní nástroj pro nekontrolovanou analýzu metabolomických změn spojených s buněčnou senescencí. Kombinace MS-DIAL pro feature detection, MetaboAnalyst pro statistiku a LabSolutions Insight Explore pro identifikaci poskytla robustní postup od akvizice po biologickou interpretaci. Studie identifikovala několik slibných kandidátů na biomarkery stárnutí, které vyžadují následnou validační fázi a kvantitativní stanovení.

Reference

1. Spicer R., Salek R., Steinbeck C. A decade after the metabolomics standards initiative it's time for a revision. Sci Data. 2017;4:170138.