Quantification of Inorganic Counterions Using Hydrophilic Liquid Chromatography Coupled with Charged Aerosol Detection (CAD)

Význam tématu

Analýza anorganických protějšků v léčivých látkách je klíčová pro potvrzení správného tvoření solí, stanovení stechiometrie, zajištění rozpustnosti, stability a biologické dostupnosti léku. Protitělesa postrádají chromofor, proto běžná UV detekce selhává. Metody jako iontová chromatografie, kapilární elektroforéza či ELSD mají omezení (oddělené podmínky pro kationty a anionty, omezená linearita, proměnlivá odpověď). HILIC v kombinaci s detekcí Charged Aerosol Detection (CAD) nabízí univerzální LC-platformu pro současné stanovení aniontů i kationtů s dobrou kvantifikací a snadnou integrací do regulačních pracovních postupů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit HILIC-CAD metodu pro simultánní separaci a kvantifikaci běžných anorganických protějšků v léčivých látkách: chlorid (Cl-), dusičnan (NO3-), sodík (Na+), fosfát (PO43-), draslík (K+), vápník (Ca2+) a hořčík (Mg2+). Studie hodnotila chromatografii na koloně Atlantis Premier BEH Z‑HILIC a optimalizovala parametry CAD (teplota odpařovače, iontová past, power function value) s ohledem na intenzitu signálu, šum a linearitu kalibrací. Metoda byla validated v rozsahu 10–160 µg/mL a aplikována na reálné vzorky (losartan K, metformin HCl, memantin HCl, ranitidin HCl).

Použitá metodika a instrumentace

• Systém: Arc HPLC System s termostatem kolony a aktivním předehřevem.
• Kolona: Atlantis Premier BEH Z‑HILIC, 5 µm, 4.6 × 150 mm.
• Mobilní fáze: acetonitril (A) a voda (B) s přidáním 200 mM amonného formiátu (C) a 2 % kyseliny mravenčí (D) pro úpravu ionizačních podmínek; gradientní režim použit pro separaci.
• Podmínky: teplota kolony 45 °C, průtok 1.3 mL/min, objem injekce 10 µL, teplota vzorku 20 °C.
• Detekce: Waters Charged Aerosol Detector; nastavení: PFV 1.30, evaporátor 45 °C, ion trap 40 V, sampling rate 10 pts/s, filter time constant 1.00 s.
• Software: Empower 3.6.0 pro akvizici a zpracování dat.
• Příprava standardů a vzorků: standardní směsi 10–160 µg/mL (každý ion), jednotlivé zásobní roztoky 2 mg/mL; vzorky léčiv rozpuštěny ve vodě/acetonitrilu 50:50 na 0.2 mg/mL.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografie HILIC umožnila baseline separaci všech sedmi sledovaných protějšků z jediné kolony, včetně současného eluce aniontů a kationtů. Volné báze léčiv byly od protějšků dobře odděleny; memantin nebyl detekovatelný CAD kvůli své vysoké volatilitě.
• Optimalizace CAD parametrů:
  • Evaporátor: zkoušeny 25–80 °C; 45 °C dalo nejlepší kompromis mezi nízkým šumem a vysokým S/N.
  • Iontová past: rozsah 20–100 V; 40 V redukovalo šum a udrželo silný signál pro kritické ionty (např. dusičnan).
  • Power Function Value (PFV): PFV=1.30 výrazně zlepšil linearitu signálu v rozsahu 10–160 µg/mL oproti defaultní hodnotě 1.00, snížil rezidua a zvýšil R2.
• Lineární kvantifikace: při použití lineárního fitu s 1/x vážením byly dosaženy korelační koeficienty ≥ 0.998 pro všechny protějšky. Mezi-denní opakovatelnost (n=10, tři dny) vykázala RSD ploch ≤ 1.15 % a USP rozlišení zůstalo stabilní.
• Recovery a přesnost: měření protějšků v léčivých látkách ukázala recoveries 99–103 % s RSD ≤ 0.80 % (n=6), což potvrzuje přesnost stanovení a vhodnost metody pro QC aplikace.
• Výpočet koncentrací: obsah jednotlivých iontů byl vypočten z molačního poměru soli a molekulových hmotností složek, což umožnilo přímé porovnání naměřených a teoretických hodnot.

Přínosy a praktické využití metody

• Simultánní analýza aniontů i kationtů na jediné HILIC kolóně zjednodušuje workflow, šetří čas a materiál oproti separátním IC metodám.
• CAD poskytuje konzistentní, široce použitelnou detekci pro sloučeniny bez UV chromoforu s lepší liniaritní odezvou (po optimalizaci PFV) než ELSD.
• Metoda je vhodná pro vývoj léčiv, kontrolu jakosti a uvolňovací testy, jelikož kombinuje vysokou přesnost (recoveries ~100 %) a opakovatelnost (nízké RSD).
• Integrace CAD s Empower umožňuje compliance-ready zpracování dat, auditní stopu a hladké reportování v regulačních prostředích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na širší spektrum anorganických a polární organických protějšků, včetně vícevalentních iontů a organických kyselin, s optimalizací mobilní fáze a PFV pro specifické analyty.
• Automatizovaná příprava vzorků a použití vyššího stupně paralelismu HPLC systémů pro zvýšení throughputu v toxikologii a průmyslové kontroly.
• Možnosti kombinace HILIC-CAD s hmotnostní spektrometrií pro strukturové ověření neidentifikovaných iontů či stopových nečistot.
• Vývoj robustních referenčních postupů pro validaci CAD v regulovaných laboratořích a standardizace PFV a iontové pasti pro typické třídy protějšků.

Závěr

Vyvinutá HILIC‑CAD metoda pro simultánní kvantifikaci běžných anorganických protějšků poskytuje spolehlivou, přesnou a reprodukovatelnou platformu vhodnou pro farmaceutický vývoj a kontrolu kvality. Optimalizace parametrů CAD (evaporátor 45 °C, ion trap 40 V, PFV 1.30) byla klíčová pro dosažení vysoké linearity a nízkého šumu. Metoda nabízí praktické výhody oproti tradičním přístupům a je připravena pro nasazení v rutině laboratorních i regulačně orientovaných procesů.

Reference

1. Mithu M.S.H., Economidou S., Trivedi V., Bhatt S., Dourouis D. Advanced Methodologies for Pharmaceutical Salt Synthesis. Crystal Growth & Design, 21 (2021) 1358–1374.
2. Bouchot P., Foulon C., Lecoeur M. Determination of the stoichiometry between a drug and its counter-ion by supercritical fluid chromatography using ultraviolet and evaporative light scattering detections: Application to ondansetron hydrochloride. Talanta, 210 (2020) 121166.
3. Streuli A., Coxon C.R., Steuer C. Simultaneous Quantification of Commonly Used Counter Ions in Peptides and Active Pharmaceutical Ingredients by Mixed Mode Chromatography and Evaporative Light Scattering Detection. Journal of Pharmaceutical Sciences, 110 (2021) 2997–3003.