Selective Glycopeptide Signal Enhancement Using the Athena Ion Processor in the Collision Cell on a timsUltra AIP system

Význam tématu

Glykopeptidová analýza hmotnostní spektrometrií je klíčová v glykoproteomice, ale trpí nízkou ionizační účinností, slabou intenzitou prekurzorů a laboratorně nestabilními glykany. To omezuje kvalitu MS/MS spekt­r a snižuje jistotu při přiřazení glykanových struktur, zejména u Y-íonů nutných pro strukturální informace. Zvýšení přenosu iontů na úrovni hardware nabízí cestu ke zvýšení citlivosti bez kompromisů v průtoku nebo spotřebě vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyhodnotit a optimalizovat Athena Ion Processor (AIP) — RF založené zařízení integrované do kolizní buňky systému timsTOF Ultra — pro selektivní zvýšení přenosu glykopeptidových prekurzorů a fragmentů v definovaných m/z a iontově-mobilitních (IM) intervalech. Postup zahrnoval optimalizaci parametrů AIP (RF amplituda, sklon rampy/slope, základní čas ukládání) na standardu a následnou aplikaci nastavení na biologické vzorky (HILIC-enriched N-glycopeptidy z HeLa digestů) s cílem zlepšit intenzity prekurzorů, diagnostické oxonium ionty a Y-iony a tím i kvalitu MS/MS spekter a identifikace.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém: timsTOF Ultra vybaven Athena Ion Processor (AIP) v kolizní buňce.
• Chromatografie: nanoElute LC, HILIC obohacení N-glykopeptidů z HeLa; injekce 100 ng; gradient 30 minut.
• Standard pro optimalizaci: digešt alfa-1-kyselého glykoproteinu (10 ng/µL) použitý pro přímou infuzi a nastavení parametrů AIP.
• Parametry AIP testované: RF amplituda (hlas­titost pole), tvar rampy (slope) – lineární/strmější profily a základní (base) doba ukládání iontů; také časové okno pro TOF pulzy a AC/DC komponenty používané k manipulaci iontů.
• Hodnocení výkonu: monitorování intenzity prekurzorů, intenzit oxonium iontů, Y-ionů a celkové kvality MS/MS; MRM-based experimenty pro cílené srovnání.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizací RF, slope a base storage time bylo možné selektivně vylepšit přenos iontů v rámci definovaných m/z a IM oken. V praxi to vedlo k nárůstu intenzity prekurzorů a fragmentů.
• AIP umožnil širší či užší přenosové okno v závislosti na nastavení: vyšší RF a strmější slope směrovaly přenos k vyšším m/z a více fokusovaly heatmapu, zatímco delší base storage preferentialně retinovaly větší ionty.
• Zvýšení intenzity oxonium iontů a hlavně Y-ionů významně zlepšilo informační hodnotu MS/MS spekter, což usnadnilo přiřazení glykanové struktury.
• V aplikaci na HILIC-obohacené HeLa vzorky optimalizovaný AIP vedl k výraznému nárůstu identifikací: glycoPSMs +42.3 %, unikátní glykopeptidy +38.6 % a unikátní glykoprekurzory +42.4 % oproti referenčním nastavením (Ultra2). Kromě kvantitativního nárůstu došlo i ke zlepšení kvality spekter pro konfidenční identifikace.
• MRM experimenty a šablony EIC/heatmap ukázaly, že pro efektivní MS2 je potřeba širší přenos zahrnující nízkomasové oxonium ionty, středněmasové b,y ionty a vysokomasové Y-iony současně; AIP nastavitelnost toto umožnila.

Přínosy a praktické využití metody

• Hardwarové zlepšení přenosu iontů umožňuje zvýšit citlivost bez nutnosti zvyšovat množství vzorku nebo prodlužovat chromatografické běhy, čímž se zachová vyšší průchodnost laboratoře.
• Zvýšená intenzita Y-iontů vede ke spolehlivějším glykanovým přiřazením, což je kritické v glykoproteomickém mapování, biomarkerovém výzkumu a farmaceutické QC.
• Flexibilní kontrola AIP parametrů umožňuje přizpůsobit přenos specifickým analytickým cílům — od citlivého detekování oxonium markerů po podporu sekvenčních fragmentů pro strukturální interpretaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření AIP-style manipulace iontů do dalších tříd modifikovaných peptidů (např. fosfopeptidy, lipidy) pro zvýšení selektivity a citlivosti.
• Integrace inteligentního řízení ramp/filtrů na základě iontové mobility (IM-guided ramping) a reálného času pro optimalizaci během LC běhu.
• Vývoj standardizovaných protokolů AIP nastavení pro různé typy glykanových populací a workflow, včetně automatizovaného nápovědného softwaru pro volbu RF/slope/base time podle IM–m/z heatmap.
• Pokročilé kombinace s datově řízenými přístupy (DDA/DIA hybridy) pro maximalizaci využitelné informační kapacity 4D (m/z, intenzita, IM, čas).

Závěr

Systematická optimalizace Athena Ion Processor v timsTOF Ultra prokázala, že řízená RF manipulace iontů v kolizní buňce dokáže selektivně zvýšit přenos glykopeptidových prekurzorů a fragmentů. Výsledkem je vyšší intenzita prekurzorů, bohatší MS/MS spektra s výrazně zesílenými Y-iony a významné nárůsty v počtu glykoPSM, unikátních glykopeptidů a glykoprekurzorů při zachování krátkých LC běhů a nízké spotřeby vzorku. Tento přístup představuje praktické zlepšení pro glykoproteomické studie vyžadující vysokou citlivost a strukturální jistotu.

Reference

• Bai H., Assis D., Marx K., Jones B., Krawitzky M., Willetts M. Selective Glycopeptide Signal Enhancement Using the Athena Ion Processor in the Collision Cell on a timsUltra AIP system. Bruker, 2026. (Autoři zaměstnanci Bruker; materiál pro výzkumné použití, ne pro diagnostické účely.)